Name: تصور في Proprioceptors ذبابة الفاكهة يرقات وشرانق (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: استكشف تقنية التصوير المناعي لأعضاء الكوردوتونال في يرقات وشرانق ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster. تُتيح هذه الطريقة دراسة تطور الأعضاء الحسية العميقة بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أود أن أشكر البنك التنموي ورم هجين الدراسات في جامعة ولاية ايوا لارسال لنا الأجسام المضادة. وقد أيد هذا العمل عن طريق منحة (رقم 29/08) من مؤسسة العلوم اسرائيل. كما يدعم أيضا من خلال منحة بحثية من DFG (دويتشه Forschungsgemeinschaft).

قبل أن تبدأ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الثقافات ذبابة المطلوب. الحفاظ على قارورة غير مزدحم (حوالي 30 الذباب في قارورة مل 50). السماح للذباب وضع البيض ليوم واحد فقط في كل قنينة. وسيوفر هذا العرض يرقات الغذاء الكافي، والسماح لهم للوصول إلى حجم القصوى قبل الزحف للخروج من المواد الغذائية. الحفاظ على قارورة في درجة حرارة مناسبة حتى 3 يرقات الطور تبدأ في التجول على جدار القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد الأوراق المالية الجديدة من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وPBT (0.1٪ توين في برنامج تلفزيوني). ابقاء 10 مل من برنامج تلفزيوني على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1-5 مل من مثبت الطازجة (فورمالديهايد 4٪ في PBT) وابقائه على الجليد. نحن نستخدم المعبأة الفورمالديهايد 37-38٪ كحل الأوراق المالية. </li></ol> 1. تشريح والتثبيت من يرقات العمر الثالث <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار تجول يرقة الطور الثالث من جدار القارورة ووضعه في انخفاضا بنسبة 50 ميكرولتر من الجليد الباردة في برنامج تلفزيوني على طبق تشريح Sylgard (مصنوعة من 184 Sylgard سيليكون عدة الاستومر، شركة داو كورنينج فيالأنسجة صحن الثقافة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد يرقة، الجانب الظهري تصل بالقرب من فم السنانير، وذلك باستخدام ملقط غرامة (دومون # 5 ملقط)، وعصا 1 دبوس حشرة (minutien، 0.1 ملم، الفولاذ المقاوم للصدأ) من خلال الدماغ اليرقة و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على نهاية الخلفي لليرقة مع ملقط، برفق وتمتد اليرقة بالطول بلطف. عصا آخر دبوس حشرة بين spiracles 2 الخلفي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع مقص ربيع باستخدام اثنين من الشقوق الأفقية في جدار الجسم (عمودي على محور الأمامي، الخلفي)، على مقربة من المسامير الأمامية والخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص ربيع قطع جدار الجسم اليرقات على طول خط الوسط ظهري من سابقة لشق الخلفي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأعضاء الداخلية (الأمعاء الغليظة، والغدد اللعابية، مالبيغي الأنابيب وغيرها) والقصبة الهوائية واستخدام الملقط غرامة. غسل بلطف مرة أو مرتين مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على حائط الجسم 2 اللوحات بالملقط، وتمتد بها وارجاعهم الى لوحة باستخدام اثنين من المسامير حشرة لكل جانب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة فBS وإضافة 50 ميكرولتر من محلول التثبيت (الفورمالديهايد 4٪ في PBT). احتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مثبت. غسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. سحب دبابيس للحشرات. قطع مقص ربيع باستخدام الرأس والذيل اليرقات ترك شرائح مستطيلة. نقل الأنسجة الثابتة لأنبوب إيبندورف المبردة مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم إصلاح عدد كاف من اليرقات، ويمكن للمرء أن يستمر مباشرة إلى تلطيخ الجسم المضاد. إذا لم يتم المطلوب تلطيخ فوري، يجب غسلها اليرقات ثابت 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما، مع الايثانول 95٪ وتخزينها في الايثانول 95٪ عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. </li></ol> 2. تشريح والتثبيت من شرانق الجزء الأول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حضور لقوارير كما لتثبيت اليرقات، وحتى 3 يرقات الطور تبدأ pupariate. دراسة قارورة كل ساعة ويرقات علامة التي pupariated. السماح للعذارى ملحوظ لتطوير ساعات 30-40 درجة مئوية في 24، أو ساعات 24-27 في 29 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط غرامة اختيار 20-30 الشرانق من السن ه المناسبة ووضعها في صحن الظلام متعددة جيدا الخزف تشريح. يجب الحرص على عدم تلف الأنسجة من الاهتمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الشرانق من حالة العذراء. تبدأ تقشير قبالة الوصاد وتستمر حتى خادرة مجانا. وضع خادرة إلى تعبئة بئر مع PBT. تواصل استخراج كل الشرانق. وينبغي القيام بالخطوات 2،4-2،6 على دفعات صغيرة من خمسة الشرانق في وقت واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 وضع الشرانق على سطح مستو بين الآبار للطبق تشريح. باستخدام سكين تشريح قطع صغيرة غيض من الرأس والطرف الخلفي من البطن (بدلا من ذلك، فمن الممكن استخدام اثنين من أزواج من ملقط لتمزيق الثقوب في كلا طرفي عذارى). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد خادرة في مكان باستخدام ملقط غرامة واستخدام حقنة 1 مل لغسل الأعضاء الداخلية للخادرة، عن طريق حقن PBT من خلال فتح الأمامي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لفترة وجيزة خادرة تشريح بواسطة غمس في ملأ بئر مع برنامج تلفزيوني ونقله إلى مثبت الباردة في أنبوب إيبندورف أبقى على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بين عشية وضحاها (ON) في 4 درجات مئوية. </li></ol> الجزء الثاني <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل تثبيتي، وغسل الشرانق ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما، مع PBT. الحفاظ على الشرانق غسلها على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل بئرين للطبق تشريح مع PBT. باستخدام مادة البولي ايثيلين نقل ماصة باستير الشرانق عدة إلى واحدة من الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أحد خادرة في وقت واحد إلى البئر الثانية. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط حاد مع نصائح المنحازة تماما، تقشر بشرة شفافة والعذراء من الجناح: تأمين خادرة إلى الجزء السفلي من زوج واحد باستخدام ملقط جيدا، وتمزيق بلطف بشرة باستخدام الزوج الثاني من الملقط. بمجرد مزقت إهاب، قشر تشغيله الجناح. يجب الحرص على عدم قطع الاتصال الجناح من خادرة. بعد تقشير قبالة إهاب من شفرة جناح، ما زالت تقشير للبشرة من العامل الحاسم في الجناح (حيث توجد ChOs جناح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تقشير بشرة قبالة الجناح، يمكن للمرء أن يحاول تقشير بشرة قبالة المحطة بطريقة مماثلة.الساقين كثير من المرجح أن تضيع في هذه العملية، ولكن على الرغم من العائد المنخفض، ينصح بشدة هذه الخطوة نظرا لأنه يحسن كثيرا من تلطيخ من ChOs الساق. لا يمكن للChOs من haltere والبطن يمكن تصور دون تقشير مزيد قبالة بشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع &quot;مقشرة&quot; خادرة في أنبوب إيبندورف مليئة الميثانول والحفاظ على درجة حرارة الغرفة. يواصل تقشير قبالة إهاب من الشرانق في كل شيء، وإضافتها إلى أنبوب واحد. وينبغي جمع ما لا يقل عن 10 الشرانق مقشر لطيف لكل تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الميثانول ويغسل ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما، مع الايثانول 95٪. يمكن أن تظل ثابتة لالشرانق فترات طويلة من الزمن في الايثانول 95٪ عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. </li></ol> 3. المناعية من اليرقات والشرانق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل النسيج ثابتة مع ثلاث مرات PBT، 30 دقيقة لكل منهما، في درجة حرارة الغرفة. يمكن غسلها اليرقات مع الهز لطيف على طبق من الدورية. تغسل الشرانق دون أن تهتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال PBT مع عازلة تمنع (PBT + 5٪ نormal مصل الماعز)، واحتضان ON في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المنطقة العازلة الحجب واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية (المخفف في عرقلة العازلة) على درجة مئوية في تمام الساعة 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أربع مرات مع PBT كما هو موضح في الخطوة 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBT واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (المخفف في عرقلة العازلة) ON في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل مرتين مع PBT ومرة ​​واحدة مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال برنامج تلفزيوني مع تصاعد المتوسطة (داكو نيون متوسطة تركيب (داكو Cytomation، ببلاغ الدنمارك)، واحتضان في 4 درجات مئوية ON. </li></ol> 4. تصاعد من يرقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليرقات هي التي شنت على شريحة المجهر في قطرة من وسائل الاعلام المتزايدة مع بشرة من أسفل الجسم وعضلات جدار مواجهة. وضع قطرة صغيرة من وسط تصاعد على زلة غطاء نظيف واستخدامه لتغطية إعداد. لا يتم تطبيق أي ضغط على اليرقات التي شنت. </li></ol> 5. تصاعد من الشرانق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الشرائح المجهر 2مع انخفاض بنسبة متوسطة متزايدة، واحدة للتشريح، والثانية للتركيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشرانق عدة على واحد من الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقص ربيع باستخدام إزالة الرأس والجزء الخلفي من البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل في النصف الظهري للصدر من النصف البطني عن طريق قطع بين الجناحين والساقين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أجزاء الجسم تشريح للخادرة على الشريحة الثانية في مجهر قطرة من حل في تصاعد مستمر. ضمان امتدت أجنحة وأرجل بها ومحاولة للتقليل من تتراكب من الأنسجة إلى أقصى حد ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قطرة من متوسطة متزايدة على زلة غطاء ووضعه على عينة. لا يتم تطبيق الضغط على العينة التي شنت. </li></ol> 6. ممثل النتائج ويظهر مثال المناعية الملون ChOs من يرقة الطور الثالث في الشكل 1. هذا المثال يوضح قطعة تمتد لطيف في البطن التي سبعة من ChOs الثمانية هي واضحة للعيان. الخلايا العصبية هي مختبرإليد مع MAb22C10 (1:20، تم الحصول عليها من البنك التنموي ورم هجين الدراسات في جامعة أيوا)، وصفت وكأب، والرباط، وكأب التعلق والارتباط الخلايا الرباط مع αTub85E المضادة (1:10، كلاين وآخرون،. 2010). وكانت الأجسام المضادة الثانوية لتلطيخ فلوري Cy3، أو Cy5 مترافق anti-mouse/rabbit (1:200، جاكسون Immunoresearch مختبرات). واعتبرت عينات من استخدام متحد البؤر المجهري (LSM 510، زييس). وترد مجموعة من ChOs جناح في الوريد الكعبري بطني من خادرة ساعة من العمر 35 في الشكل 2. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig1.jpg" /> الشكل 1 (أ) توضيح تخطيطي لأنواع الخلايا الست التي تشكل جهازا الفصل واحد:. مرفق قبعة (CA)، وكأب (C)، scolopale (S)، الخلايا العصبية (N)، الرباط (L) والرباط المرفق (لوس انجليس ). ويمتد الجهاز LCh5، التي تتجمع في 5 ChOs، عبر مجموعة من العضلات عرضية جانبية (LT1-4). ويتضح أيضا في العضلات الجانبية الطولية (LL1)، عضلات بطني طولي (VL1-4) والعضلات المائلة الجانبية (LO1). ويوضح الخلايا وتر ومجالات البني (مأخوذة من كلاين وآخرون، 2010). (ب) جزء واحد في البطن من يرقة الطور 3 الاطلاع على التكبير 10x. سبعة من ChOs 8 الحالي في كل جزء من البطن واضحة: الأجهزة الجانبية الخمسة التي تشكل معا الجهاز pentascolopidial (LCh5)، وهو جهاز واحد جانبي (LCh1) واحد من اثنين من ChOs بطني (VChB). وصفت الخلايا العصبية (N) من ChOs مع 22C10 علامة ماب العصبية (الحمراء). تتم تسمية في الرباط (L)، وكأب (C) والخلايا المرفق (لوس انجليس، كاليفورنيا) مع المضادة للαTub-85E (الأزرق). وبالإضافة إلى ذلك وصفت الخلايا قبعة والرباط مع مراسل GFP تشو الخاصة بإيواء أحد العناصر التنظيمية من مكان دي (نحمان وآخرون، بيانات غير منشورة). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig2.jpg" /> الشكل 2. </sوينظر إلى ترونج&gt; الأجهزة جناح chordotonal في الوريد الكعبري بطني في تكبير 40X. وتتميز الخلايا العصبية (N) مع 22C10 علامة العصبية (الأحمر، B). يتم في الرباط (L) وقبعة (C) خلايا شارك في المسمى مع المضادة للαTub85E الأجسام المضادة (أزرق، C) ومراسل GFP تشو محددة التحوير (ناخمان وآخرون، بيانات غير منشورة).

<ol><li>Brewster, R., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+specification+of+type+II+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila.</a> Development. 121, 2923-2936 (1995).</li>
<li>Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+larval+locomotion+in+Drosophila+chordotonal+organ+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).</li>
<li>Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeling+the+vibes%3A+chordotonal+mechanisms+in+insect+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).</li>
<li>Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Johnston%27s+organ+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of Johnston's organ in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).</li>
<li>Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+similar+transduction+mechanisms+for+touch+and+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).</li>
<li>Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+adhesion+in+the+Drosophila+wing+is+mediated+by+Delilah%2C+a+potent+activator+of+%CE%B2PS+integrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression.</a> Dev Biol. 351, 99-109 (2011).</li>
<li>Field, L. H., Matheson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordotonal+organs+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chordotonal organs of insects.</a> Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).</li>
<li>Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+interdependent+TRPV+channel+subunits%2C+inactive+and+Nanchung%2C+mediate+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).</li>
<li>Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+ectodermal+attachment+cells+via+an+EGFR-dependent+mechanism+during+the+organogenesis+of+Drosophila+proprioceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors.</a> Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).</li>
<li>Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((atonal+is+a+proneural+gene+that+directs+chordotonal+organ+formation+in+the+Drosophila+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system.</a> Cell. 73, 1307-1321 (1993).</li>
<li>Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+proneural+gene%2C+atonal%2C+in+formation+of+Drosophila+chordotonal+organs+and+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors.</a> Development. 121, 2019-2030 (1995).</li>
<li>Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRPV+family+ion+channel+required+for+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila.</a> Nature. 424, 81-84 (2003).</li>
<li>Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprioceptive+and+contractile+systems+in+Drosophila+are+both+patterned+by+the+EGR+family+transcription+factor+Stripe%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe.</a> Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).</li>
<li>Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+implications+of+the+unusual+spatial+distribution+of+a+minor+alpha-tubulin+isotype+in+Drosophila%3A+a+common+thread+among+chordotonal+ligaments%2C+developing+muscle%2C+and+testis+cyst+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells.</a> Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).</li>
<li>Okabe, M., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+induction+of+chordotonal+organ+precursors+in+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis.</a> Development. 124, 1045-1053 (1997).</li>
<li>Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spalt+modifies+EGFR-mediated+induction+of+chordotonal+precursors+in+the+embryonic+PNS+of+Drosophila+promoting+the+development+of+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes.</a> Development. 128, 711-722 (2001).</li>
<li>Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+molecular+design+of+the+Drosophila+antenna+as+a+flagellar+auditory+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ.</a> Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).</li>
<li>zur Lage, P., Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+EGFR+and+notch+signalling+in+the+reiterative+recruitment+of+Drosophila+adult+chordotonal+sense+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors.</a> Development. 126, 3149-3159 (1999).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

البروتوكول المذكور في هذا الفيديو يوفر وسيلة لتصور ChOs التحفيز خلال مراحل اليرقات والعذراء. وقد دراسات حول بنية وتطوير ChOs التحفيز حتى الآن تقتصر أساسا على مراحل الجنينية وعلى أقراص تخيلي اليرقات. وبالتالي، جوانب كثيرة من مراحل لاحقة من التطور، من ChOs على حد سواء اليرقات والكبار، لا تزال مجهولة إلى حد كبير. ويمكن استخدام بروتوكول صفها، جنبا إلى جنب مع أدوات الوراثية الشائعة في ذبابة الفاكهة، لتحديد ودراسة جينات جديدة والممرات التي تؤدي دورا في مراحل لاحقة من تطوير ChOs. وكان هذا البروتوكول الأمثل للتصور تشو، ولكن يمكن تكييفه لتلطيخ من الأنسجة الأخرى، مثل أجنحة العذراء 6.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف / أداة </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> دومون # 5 (أو # 55) ملقط، البيولوجيا غيض </td><td> FST </td><td> 11252-20 أو 11252-10 (ملقط أو ما شابه) </td><td></td></tr><tr><td> أوسترليتز حشرة الفولاذ المقاوم للصدأ المسامير، minutiens 0.1mm </td><td> Roboz شركة أداة جراحية </td><td> RS-6083-10 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard الاستومر سيليكون 184 طقم </td><td> شركة داو كورنينج </td><td> 240.4019862 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas الدقيقة المقص (مستقيم، 7.5 سم، شفرة 3mm) ل </td><td> AS Mdeizintechnik محدودة </td><td> 11-590-00 </td><td> ويمكن شراء مقص الربيع Vannas مع مواصفات مماثلة من الصك Roboz شركة الجراحية </td></tr><tr><td> المداري شاكر - Rotamax-120 </td><tد&gt; Heidolph </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> داكو نيون تركيب متوسطة </td><td> داكو Cytomation، ببلاغ الدنمارك </td><td> DK-5302392 </td><td></td></tr><tr><td> X10 صياغة برنامج تلفزيوني </td><td colspan="2"> 2 غرام / بوكل مضاءة، 2 غرام / مضاءة KH 2 PO 4، 80 غرام / مضاءة كلوريد الصوديوم، 21.7 غرام / مضاءة نا 2 HPO4.7H 2 O </td><td> جودة في برنامج تلفزيوني هو أمر حاسم لنجاح هذا البروتوكول </td></tr><tr><td> PBT </td><td colspan="2"> X1 PBS + 0.1٪ توين 20 </td><td></td></tr></tbody></table>

تصور في proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

استقبال الحس العميق هو القدرة على استشعار الحركة، أو موقف، من أجزاء الجسم من خلال الاستجابة للمحفزات التي تنشأ داخل الجسم. في fruitflies وغيرها من الحشرات وتقدم بوضع الجسم بواسطة الحواس المتخصصة ووصف الأجهزة chordotonal (ChOs) 2. مثل العديد من الأجهزة الأخرى في ذبابة الفاكهة، ChOs تطوير مرتين خلال دورة حياة الذبابة. أولا، تطوير ChOs اليرقات خلال مرحلة التطور الجنيني. ثم، وChOs الكبار تبدأ في تطوير أقراص وتخيلي اليرقات والاستمرار في التفريق خلال مسخ. وقد تمت دراسة وضع ChOs اليرقات على نطاق واسع خلال مرحلة التطور الجنيني 10،11،13،15،16. محور كل تشو هي وحدة حسية تتكون من الخلايا العصبية والخلايا scolopale. ويمتد وحدة حسية بين نوعين من الخلايا التبعي أن نعلق على بشرة عن طريق خلايا متخصصة مرفق البشرة 1،9،14. عندما يتحرك يرقة الذبابة، وتشريد النسبية للبريدخلايا مرفق pidermal يؤدي إلى تمتد من وحدة حسية والانفتاح يترتب على ذلك من إمكانات محددة مستقبلات عابر قنوات (TRPV) vanilloid في الجزء الخارجي من 8،12 التغصنات. ثم يتم نقل الإشارة إلى أثار الحركي المركزي نمط دائرة مولد في الجهاز العصبي المركزي. وقد وصفت ChOs متعددة في ذبابة الكبار 7. وتقع بالقرب من هذه المفاصل من الزوائد ذبابة الكبار (الساقين، وأجنحة والارسنه) وكذلك في الصدر والبطن. وبالإضافة إلى ذلك، عدة مئات من ChOs تشكل مجتمعة الجهاز جونستون في الهوائي الكبار أن transduce الصوتية إلى طاقة ميكانيكية 3،5،17،4. وعلى النقيض من معرفة واسعة عن تطور ChOs في مراحل جنينية، ولا يعرف سوى القليل جدا عن الشكل الظاهري لهذه الأجهزة خلال مراحل اليرقات. وعلاوة على ذلك، مع استثناء من ChOs الفخذ 18 و الجهاز جونستون، لدينا knowledشركة جنرال الكتريك عن تطور وهيكل ChOs في الذبابة الكبار مجزأة جدا. نحن هنا وصف طريقة لتلطيخ وتصور ChOs في يرقات العمر الثالث والشرانق. ويمكن تطبيق هذه الطريقة مع الأدوات الوراثية لتوصيف أفضل للمورفولوجيا وفهم تطور ChOs مختلف في الطيران.

وهناك طريقة لimmunostain ووضع تصور لأجهزة chordotonal في يرقات وعذارى من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</emيوصف&gt;.

تصور في Proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

تُعدّ استقبال الحس العميق (Proprioception) القدرة على استشعار حركة أجزاء الجسم أو وضعيتها من خلال الاستجابة للمنبهات الناشئة داخل الجسم. وفي ذباب الفاكهة وغيره من...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور أعضاء كورتون (cortone organs) الخاصة باستقبال الحس العميق في يرقات وعذارى ذبابة الفاكهة (drosophila). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تربية وجمع يرقات المرحلة الثالثة أو العذارى، ثم تشريح اليرقات أو العذارى، وتثبيتهم من أجل الصبغ المناعي.بعد ذلك، يتم إجراء صبغ مناعي لليرقات أو الخادرات المثبتة باستخدام الأجسام المضادة المناسبة. والخطوة النهائية هي تثبيت العينات المصبوغة للفحص المجهري. وفي النهاية، يُستخدم المجهر البؤري (confocal microscopy) لتصوير الأعضاء القورتونية.يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية حول التطور ما بعد التكافلي وتنميط مستقبلات prop في oph. ورغم أن هذا الإجراء قد يقدم رؤى حول تطور مستقبلات prop، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضاً على أعضاء أخرى مثل الأنواع الأخرى من الأعضاء الحسية والأوتار. أولاً، قم بتجهيز الأدوات والمحاليل اللازمة وقارورة من wandering.بالنسبة ليرقات المرحلة الثالثة (third instar larvae)، يُحفظ محلول PBS ومحلول التثبيت (FIXATIVE) على الثلج. يتم التقاط يرقة من المرحلة الثالثة تتحرك على جدار القارورة ووضعها في قطرة بحجم 50 µL من محلول PBS المثلج على لوح تشريح مصنوع من المطاط المرن (cigar elastomer) داخل طبق زراعة أنسجة. وباستخدام مجهر تشريحي، تُثبت اليرقة بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى، مع الإمساك بها بالقرب من خطافات الفم باستخدام ملقط دقيق، ثم يتم غرز دبوس حشرات عبر الدماغ.أمسك الطرف الخلفي لليرقات باستخدام الملقط. اسحب اليرقات برفق ومدها طولياً. ثبّت دبوس حشرات آخر بين الكرتين الخلفيتين باستخدام مقص زنبركي.قم بإجراء شقين أفقيين في جدار الجسم بشكل عمودي على المحور الأمامي الخلفي، مع البقاء بالقرب من الدبابيس الأمامية والخلفية. بعد ذلك، قم بشق جدار جسم اليرقة على طول الخط الناصف الظهري من الشق الأمامي إلى الشق الخلفي. قم بإزالة الأعضاء الداخلية والقصبات الهوائية باستخدام ملقط دقيق.بعد ذلك، اغسل العينة بلطف مرة أو مرتين باستخدام PBS. أمسك رفرفي جدار الجسم بواسطة الملقط. قم بمدهما وتثبيتهما على الطبق باستخدام دبوسي حشرات لكل جانب.أزل المحلول المنظم للفوسفات (PBS) وأضف 50 µL من محلول التثبيت. قم بالتحضين لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة محلول التثبيت والغسل مرتين باستخدام PBS، اسحب دبابيس الحشرات باستخدام مقص زنبركي.اقطع رأس وذيل اليرقة مع ترك قطعة مستطيلة من الجسم. انقل النسيج المثبت إلى أنبوب إبندورف مبرد يحتوي على PBS. وبمجرد تثبيت عدد كافٍ من اليرقات، يمكن الانتقال مباشرة إلى صبغ الأجسام المضادة.إذا لم يكن التلوين الفوري مطلوباً، يجب غسل اليرقات المثبتة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة باستخدام 95%ethanol، ثم تخزينها في الـ ethanol عند درجة حرارة -20 °C. يتم التعامل مع القوارير كما هو الحال في تثبيت اليرقات حتى تبدأ يرقات الطور الثالث في الانسلاخ. يتم فحص القوارير كل ساعة وتمييز اليرقات التي انسلخت.اترك العذراء المحددة لتنمو لمدة تتراوح من 30 إلى 40 ساعة عند درجة حرارة 24 °C، أو من 24 إلى 27 ساعة عند درجة حرارة 29 °C. وباستخدام ملقط دقيق، اختر من 20 إلى 30 عذراء من العمر المناسب وضعها في طبق تشريح بورسليني متعدد الفجوات ومعتم. احرص على عدم إتلاف الأنسجة المستهدفة.بعد ذلك، استخرج الخرائق من أغلفتا. ابدأ بإزالة الغطاء واستمر في ذلك حتى تتحرر الخرنقة. استخرج جميع الخرائق وضعها في بئر ممتلئ بـ PBT.ضع خمس خادرات على سطح مستوٍ بين آبار طبق التشريح باستخدام سكين تشريح دقيق. اقطع طرف الرأس والطرف الخلفي للبطن. ثبت الخادرة في مكانها باستخدام ملقط دقيق، واستخدم حقنة سعة 1 mL لغسل الأعضاء الداخلية للخادرة عن طريق حقن PBT عبر الفتحة الأمامية.اغسل الخادرة التي تم تشريحها لفترة وجيزة عن طريق غمسها في بئر مملوء بـ PBS، ثم انقلها إلى المثبت البارد في أنبوب einor محفوظ على الثلج. حضّن الخادرة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. في اليوم التالي.تخلص من المثبت واغسل الـ puby بمحلول PBT ثلاث مرات، لمدة خمس دقائق لكل غسلة. احتفظ بالـ puby المغسول في الثلج. املأ بئرين من طبق التشريح بمحلول PBT.باستخدام ماصة من البولي إيثيلين، انقل عدة عذارى إلى إحدى الآبار. ثم انقل عذراء واحدة في كل مرة إلى البئر الثانية.باستخدام زوجين من الملاقط الحادة ذات الأطراف المتطابقة تماماً، ثبت الخادرة في قاع البئر ثم قم بتمزيق الكيوتيكل برفق. يُعد إزالة كيوتيكل الجناح الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء. فنحن نفقد دائماً بعض الأجنحة خلال هذه الخطوة، ولهذا السبب نبدأ الإجراء بعدد كبير نسبياً من الخادرات.بمجرد تمزق القشيرة، قم بنزعها من الجناح، مع الحرص على عدم فصل الجناح عن العذراء. بعد نزع القشيرة من نصل الجناح، استمر في نزع القشيرة من مفصل الجناح.بمجرد تقشير كيوتيكل الجناح، يمكن محاولة تقشير كيوتيكل الساق بطريقة مماثلة. من المحتمل فقدان العديد من السيقان خلال هذه العملية، ولكن على الرغم من انخفاض المردود، يُنصح بشدة بهذه الخطوة لأنها تحسن صبغ أعضاء كورتون في الساق بشكل كبير. ضع العذراء في أنبوب إينور مملوء بالميثانول واحفظها في درجة حرارة الغرفة.استمر في تقشير كيوتيكل جميع الـ puy وأضفها إلى نفس الأنبوب للحصول على ما لا يقل عن 10 من الـ puy المقشرة جيداً. قبل كل عملية صبغ، قم بإزالة الميثانول واغسلها ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة باستخدام 95%ethanol. يمكن الاحتفاظ بـ puy المثبتة لفترات طويلة في 95%ethanol عند درجة حرارة minus 20 degrees قبل إجراء الصبغ المناعي.لتثبيت اليرقات، ضع قطرة من وسط التثبيت على شريحة مجهرية، ثم ضع اليرقات بحيث تكون القشيرات متجهة لأسفل وعضلات جدار الجسم متجهة لأعلى. ضع قطرة صغيرة من وسط التثبيت على غطاء شريحة نظيف، واستخدمه لتغطية التحضير دون تسليط أي ضغط على اليرقات المثبتة. لتثبيت البصيلة.أولاً، قم بتحضير شريحتين للمجهر بوضع قطرة من وسط التثبيت على كل منهما، واحدة للتشريح والثانية للتثبيت. ضع عدة خادرات على إحدى الشرائح، ثم استخدم مقصات الزنبرك لإزالة الرأس والجزء الخلفي من البطن. بعد ذلك، افصل النصف الظهري من الصدر عن النصف البطني عن طريق القطع بين الأجنحة والأرجل.ضع أجزاء جسم العذراء التي تم تشريحها في قطرة من وسط التثبيت. وفي الشريحة الثانية، تأكد من أن الأجنحة والأرجل ممتدة، وحاول تقليل تداخل الأنسجة قدر الإمكان. وأخيرًا، ضع قطرة من وسط التثبيت على غطاء الشريحة ثم ضعه فوق العينة دون تطبيق ضغط مفرط.تُظهر هذه الصورة المجهرية البؤرية للمناعة النسيجية لأعضاء كورتون في يرقات نجم البحر في مرحلة الثلث، قطعة بطنية ممتدة بشكل جيد يظهر فيها سبعة من أصل ثمانية أعضاء كورتون بوضوح. كما تتضح الأعضاء الجانبية الخمسة التي تشكل معاً عضو بناسكو الدهني، وعضو جانبي واحد، وأحد عضوي كورتون البطنيين. وقد تم وسم عصبونات عضو كورتون باستخدام الوسم العصبي، وهو جسم مضاد أحادي النسيلة 22 C 10، وتظهر باللون الأحمر.تم وسم غطاء الرباط وخلايا الارتباط باستخدام Antifa tubulin 85 E وتظهر باللون الأزرق. كما تم وسم خلايا الغطاء والرباط إضافياً باستخدام عضو قشري تونالي. مراسل GFP محدد يحمل عنصراً تنظيمياً لموقع Delilah.تظهر هنا أعضاء كورتي التونال (corti tonal organs) في الجناح عند الوريد الشعاعي البطني في هذه الصورة المجهرية البؤرية لشرنقة عمرها 35 ساعة. تم وسم العصبونات باستخدام الواسم العصبي 22 C 10، وتظهر باللون الأحمر في اللوحة B. كما تم وسم خلايا الرباط والغطاء معاً باستخدام أجسام مضادة لـ Antifa tubulin 85 E، وتظهر باللون الأزرق في اللوحة C، بالإضافة إلى عضو كورتي تونال. ويظهر الجين المراس GFP المحدد باللون الأخضر.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير أعضاء cortone الخاصة باستقبال الحس العميق في كل من اليرقة والعذراء في oph. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أنه تم تحسينه لاستخدام الأجسام المضادة الموصوفة؛ حيث قد تتطلب الأجسام المضادة المختلفة ظروف تثبيت وتلوين مختلفة قليلاً.وبناءً على ذلك، عند استخدام هذا الإجراء مع أجسام مضادة مختلفة، يجب تحديد الظروف المثلى للأجسام المضادة المستخدمة.

visualization-of-proprioceptors-in-drosophila-larvae-and-pupae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

يرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن توفير نظام النموذج المثالي للتحقيق في آليات النقل داخل محواري الأعصاب قطعي اليرقات. باستخدام هذا الإجراء ، يمكن مقارنة 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة تحمل طفرات مختلفة ليرقات النوع البري.

تصور الأعصاب القطاعي اليرقات في 3 الثالثة طور مرحلي ذبابة الفاكهة التحضيرات اليرقات

نحن تصف الإجراء الذي قام...

التصور الجهاز العصبي الجنينية في جبل لالجامع ذبابة الفاكهة الأجنة

هذا البروتوكول توضح طريقة موثوقة لالتخدير والتصوير من دون...

في التصوير من يرقات ذبابة الفاكهة فيفو سليمة الفرعية الخلوية في القرار

في هذا الفيديو ، ونحن تصف طريقة لتصوير الخلايا الحية لتقسيم الخلايا الاصلية غير متماثلة الحسية والجهاز سليمة في خلايا...

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

المصدر:  Jeong، S. تصور نمط الإسقاط المحوري للخلايا العصبية الحركية الجنينية في ذبابة الفاكهة . J. Vis. Exp. (2017)يوضح هذا الفيديو تصور الإسقاطات المحورية في ذبابة الفاكهة  الأجنة. يكشف وضع العلامات المناعية للخلايا العصبية الحركية ، والتشريح الدقيق لفضح الهياكل العصبية ، والفحص المجهري لتباين التداخل التفاضلي بشكل جماعي عن بنية عصبية مفصلة ، مع التركيز على أنماط الإسقاط المحوري.

تصور أنماط الإسقاط المحوري للخلايا العصبية الحركية الجنينية في ذبابة الفاكهة

يقدم هذا البروتوكول طريقة فعالة لتصوير ذبابة الفاكهة الظهارية العصبية الحية للعين العذراء. تعوض هذه الطريقة عن حركة الأنسجة والطوبولوجيا غير المتكافئة ، وتعزز تصور حدود الخلية من خلال استخدام العديد من بروتينات التوصيل الموسومة ب GFP ، وتستخدم جهاز تصوير سهل التجميع.

يعيش التصوير لل ذبابة الفاكهة العذراء العين

نحن تصف بروتوكول للتشريح، التثبيت، والمناعية من أجهزة الستيرويدي المنشأ في يرقات ذبابة الفاكهة والكبار الإناث لدراسة الستيرويد الحيوي الهرمونات وآلية التنظيمية. بالإضافة إلى أجهزة الستيرويدي المنشأ، ونحن تصور تعصيب أجهزة الستيرويدي المنشأ وكذلك الخلايا المستهدفة الستيرويدي المنشأ مثل الخلايا الجذعية سلالة الجرثومية.

بروتوكولات لتصور الستيرويدي المنشأ أجهزة وهيئات التفاعلية مع المناعية في ذبابة الفاكهة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

هذا العمل تفاصيل طريقة المناعية القياسية لتصور توقعات الخلايا العصبية الحركية من أواخر المرحلة 16 الأجنة ميلانوجاستر ذبابة الفاكهة . إعداد فيليه من الأجنة ثابتة ملطخة الأجسام المضادة فاسي يوفر أداة قوية لتوصيف الجينات المطلوبة لمحور محور عصبي باثفيندينغ والاعتراف الهدف خلال التنمية العصبية.

التصور من محور الإسقاط نمط من الخلايا العصبية المحرك الجنينية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

هنا، نحن نقدم وسيلة سهلة الاستخدام، وتنوعاً لإجراء التصوير مباشر للعمليات الإنمائية في morphogenesis العامة ووتر العضلات خاصة في المعيشة الخوادر المورفولوجية .

في فيفو تصوير Morphogenesis وتر العضلات في المورفولوجية الخوادر

هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتصور استهداف محواري مع بروتين الفلورسنت في الساقين الكبار من المورفولوجية التثبيت والمتصاعدة، والتصوير، والتصوير بعد انتهاء الخطوات.

تصور المورفولوجية الساق الحركية محاور عصبية من خلال بشرة الكبار

هنا ، يتم تقديم بروتوكول للتصوير الحي طويل الأمد لساق ذبابة الفاكهة أثناء مرحلة العذراء ، بما في ذلك الإزالة الكاملة للشادرة. يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على الأنسجة الأخرى.

تصوير حي طويل الأمد لتطور الساق ذبابة الفاكهة بعد إزالة الحفرة

استكشف تقنية التصوير المناعي لأعضاء الكوردوتونال في يرقات وشرانق ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster. تُتيح هذه الطريقة دراسة تطور الأعضاء الحسية العميقة بدقة عالية.

تصور في Proprioceptors

استكشف المزيد من الفيديوهات