إعداد خلايا الفأر الجنينية الخلايا الليفية مناسبة للالإنسان التثقيف الجنينية والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير أرومات ليفية جنينية للفئران تكون مناسبة لاستزراع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق فصل كل جنين وإزالة الرأس والأعضاء الحمراء. بعد ذلك، يتم فرم النسيج وهضمه في النهاية.

بعد ذلك يتم زرع الخلايا، بمعدل ثلاثة إلى أربعة أجنة لكل دورق وتكثيرها. وأخيراً، تُستخدم الخلايا غير النشطة لتحضير الوسط المكيف. وفي النهاية، يُستخدم e LSA لتحديد التركيز الأمثل للمادة النشطة داخل الوسط المكيف الذي يدعم النمو غير المتمايز للخلايا الجذعية متعددة القدرات.

بشكل عام، سيواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة صعوبات لأن الإجراء يحتاج إلى توحيد قياسي من أجل إنتاج أرومات ليفية جنينية للفئران ذات جودة عالية، وهو ما سيتيح النمو غير المتمايز لكل من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لأن خطوات عزل وتشريح الجنين صعبة التعلم لأن التعامل مع جنين الفأر يتطلب مهارات يدوية معينة. ستقوم الدكتورة Justina Suk، وهي باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبري، وبالاشتراك مع طالبة الدراسات العليا Caterina Dres، باستعراض هذا الإجراء.

بعد التضحية بفأرة حامل في اليوم 13 أو 14 بعد التزاوج واستئصال القرون الرحمية، اشطفها سريعاً بإيثانول 70% وضعها في أنبوب فالكون يحتوي على PBS باستخدام ظروف معقمة تحت غطاء زراعة الأنسجة. ضع القرون الرحمية في أطباق بتري وافصل كل جنين عن مشيمته وكيسه الجنيني. قم بإزالة الرأس والأعضاء الحمراء، واغسل الأجزاء المتبقية من الجنين بـ PBS وضعها في طبق بتري نظيف باستخدام شفرة حلاقة معقمة.

أخيراً، يتم فرم النسيج حتى يصبح من الممكن سحبه باستخدام الماصة. بعد ذلك، أضف 1 mL من 0.05% trypsin in EDTA و 100 K units لكل جنين من DNase I. ثم انقل النسيج إلى أنبوب Falcon سعة 50 mL وحضنه لمدة 15 دقيقة عند 37 °C.

بعد كل خمس دقائق من التحضين، قم بفصل الخلايا عن طريق السحب والضخ المتكرر باستخدام الماصة بشكل جيد. قم بإبطال مفعول التربسين بإضافة حجم واحد تقريبًا من meth.Medium المُحضّر حديثًا. ثم قم بطرد الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق بسرعة منخفضة.

قم بإزالة السائل الطافي بعناية وأعد تعليق الراسب في وسط meth دافئ، ثم جهز دوارق مطلية بـ 0.2%gelatin واتركها لتحضن لمدة ساعتين على الأقل. وفي درجة حرارة الغرفة، قم بنقل الخلايا من حوالي ثلاثة إلى أربعة أجنة إلى كل دورق مطلي بـ 0.2%gelatin. وتعد الخلايا الليفية (fibroblasts) هي الخلايا الوحيدة التي تمتلك القدرة على الالتصاق بالدوارق المطلية بـ gelatin.

بعد حوالي 24 ساعة، عندما تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 80 إلى 90%، يتم تجميد بعض الخلايا عند درجة حرارة -80 °C. وللاستخدام المستقبلي، يتم تكثير الخلايا المتبقية حتى الممر الثالث (P3) أو الممر الرابع (P4). ولتحضير الخلايا المغذية باستخدام مزارع P3 أو P4، ابدأ بطلاء دوارق T150 بـ 0.2% gelatin وتحضينها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل.

قم بتخفيف mitomycin C في PBS ومرره عبر مرشح حقنة. اسحب الوسط من الخلايا واغسلها باستخدام PBS خالٍ من الكالسيوم أو المغنيسيوم. ضع 20 milliliters من الوسط الذي يحتوي على 10 micrograms per milliliter من mitomycin C على الخلايا واتركها في الحاضنة لمدة ساعتين عند 37 degrees Celsius.

بعد ذلك، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS وقم بمعالجتها بالتربسين. بعد فترة التحضين، علّق الخلايا في وسط meth، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً وترسيبها وأعد تعليقها في وسط meth دافئ. ازرع الخلايا بكثافة 56,000 خلية لكل سنتيمتر مربع في دوارق T150، ثم حضنها طوال الليل في اليوم التالي لزراعة خلايا meth.

استبدل وسط الزرع بوسط HESC غير المكيف، والمكمل بـ 4 ng/mL طازجة من FGF2، وضعها في الحاضنة عند 37 °C. بعد 24 ساعة، اجمع الوسط المكيف من الدوارق واستبدله بوسط HESC طازج. قم بتخزين الوسط المجموع عند -20 °C.

كرر عملية الجمع لمدة ستة أيام إجمالاً بعد عملية الجمع السادسة. ادمج كل الوسط وقم بترشيحه. ثم خزنه في حصص قدرها 50 milliliter عند درجة حرارة minus 80 degrees Celsius.

لقياس النشاط في الوسط المكيف، يتم إحضار جميع العينات والكواشف إلى درجة حرارة الغرفة. خفف الجسم المضاد النشط في محلول PBS مع 1% BSA وأضف 100 µl إلى آبار لوحة دقيقة. يتم التحضين طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.

اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام PBST. ثم قم بحجب الآبار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وفي هذه الأثناء، قم بإعداد منحنى قياسي نشط، يتضمن سبعة تخفيفات وعينة فارغة باستخدام نطاق عمل من 0.25 إلى 32 nanograms per milliliter.

أضف مكررات من المعايير والعينات إلى الآبار واتركها للحضانة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام PBST. بعد ذلك، أضف جسماً مضاداً ثانوياً مبيوتناً (biotinylated secondary antibody) واتركه للحضانة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام PBST وأضف streptavidin HRP. بعد الخلط وإضافة الركيزة، غلف الجدران للحماية من الضوء واتركها لتحضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف 100 µL من محلول الإيقاف إلى كل بئر واخلط بلطف.

أخيراً، اضبط قارئ الأطباق الدقيقة على 540 nanometers مع تصحيح الطول الموجي عند 540 أو 570 nanometers، ثم حدد الكثافة الضوئية لكل بئر موضح. يظهر هنا المورفولوجيا النموذجية لخلايا h ESCs غير المتمايزة، والمستنبتة في وجود خلايا مغذية، ووسط مكيف، ووسط محدد. في هذه الأمثلة، يتم استنبات HI PSCs في وجود خلايا مغذية.

تظهر هذه الصور مورفولوجيا الخلايا المغذية (feeder cells) والخلايا المغذية المثبطة المستخدمة لتحضير الوسط المكيف. وبشكل عام، يجب أن تصل الخلايا إلى حالة الاندماج (confluent) بعد 24 ساعة من العزل، وتصبح جاهزة للتجميد أو التوسيع. ومع ذلك، قد يستغرق الأمر أحياناً من يومين إلى ثلاثة أيام قبل الحصول على مستنبتات مندمجة.

يجب تحضير الوسط المكيف من خلايا في الممر الرابع وليس بعد ذلك. وهذا أمر بالغ الأهمية لأن الخلايا الأولية لا يمكن توسيعها إلا لأربعة أو خمسة ممرات قبل بدء مرحلة الشيخوخة. ويعتبر السيتوكين النشط في a أحد أكثر العوامل حرجاً التي تفرزها الخلايا المغذية لدعم النمو غير المتمايز للخلايا متعددة القدرات.

يعد قياس مستوى النشاط في الوسط المكيف، كما هو موضح هنا، مقايسة كمية ملائمة لمراقبة جودة الخلايا. وبمجرد إتقان العملية، يمكن إتمام عزل الأرومات الليفية الجنينية للفئران في غضون ساعة إلى ساعتين إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر تربية الحيوانات مسبقاً وتجهيز وتعقيم جميع الأدوات باستخدام الموصدة مسبقاً.