توصيف المظهري والوظيفي للخلايا غشائي مستعمرة تشكيل المستمدة من الإنسان دم الحبل السري

الهدف العام من هذا الإجراء هو شرح كيفية اشتقاق الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية أو مركبات الكربون الكلورية فلورية الإلكترونية من دم الحبل السري البشري. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء الخلايا أحادية النواة أولا من دم الحبل السري ، ثم استنساخ وتوسيع نواتج مستعمرة مركبات الكربون الكلورية فلورية E تتمثل الخطوة الثانية في توصيف الخلايا في المختبر باستخدام تقنية فحص خلية واحدة جديدة لإمكانات التكاثر النسيلي.

أخيرا ، تتميز الخلايا في اختبار تشكيل الأوعية في الجسم الحي من خلال إنتاج وزرع المواد الهلامية التي تحتوي على مركبات الكربون الكلورية فلورية E في الفئران الانزلاقية. في النهاية ، يمكن تقييم التكوين في الجسم الحي للأوعية المملوءة بالدم المضيف من جديد عن طريق تلطيخ h و e لغرسات ECFC المحتوية على الغرسات الخلوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات على الطرق الحالية هي أن هذه الطرق تسمح بفحص الإمكانات التكاثرية للخلايا البطانية على مستوى خلية واحدة.

يمكن توسيع الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو إيجاد أدوات تشخيصية وعلاجية لأمراض مثل مرض الشرايين الوحشية أو مرض الشرايين المحيطية لأن هذه التقنية تسمح لنا بفحص إمكانات التكاثر والقدرة الجينية للخلايا البطانية للمريض. قبل البدء في الإجراء ، أضف ملليلترا واحدا من كولاجين ذيل الفئران ، واكتب واحدا في كل بئر من لوحة زراعة أنسجة بستة آبار ، ثم احتضن اللوحة طوال الليل في يوم الإجراء ، وقم بتقسيم دم الحبل السري في 15 مليلتر في أنابيب طرد مركزي مخروطية سعة 50 ملليلترا. ثم أضف 20 مل من PBS إلى كل أنبوب وقم بعمل ماصة الخليط لأعلى ولأسفل عدة مرات.

بعد ذلك ، اسحب 15 مل من PA في ماصة ، ضع طرف الماصة في الجزء السفلي من أنبوب الدم المخفف وقم بوضع أساس جهاز الطرد المركزي الألبك بعناية ، والأنابيب لمدة 30 دقيقة عند 740 مرة G في درجة حرارة الغرفة دون إعداد فرامل التباطؤ. بعد فصل الخلية ، استخدم ماصة نقل لإزالة الطبقة الضبابية من الخلايا أحادية النواة منخفضة الكثافة الموجودة في الواجهة بين الذروة الخورقية والبلازما المخففة. قم بتوزيع الخلايا المجمعة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من E GM اثنين من المتوسطين وحبيبات الخلايا أحادية النواة لمدة 10 دقائق عند 515 مرة G في درجة حرارة الغرفة مع إعداد فرامل التباطؤ العالي ، وشفط بعناية وتخلص من المادة الطافية.

ثم بعد غسل الخلايا المحببة باستخدام EGM مرتين ، قم بتعليقها خلايا أحادية النواة في EGM اثنين عند 1.25 في 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر. الآن ماصة أربعة ملليلتر من تعليق الخلية أحادية النواة في كل بئر من الصفيحة المطلية بالكولاجين واحتضان الخلايا حتى تتشكل المستعمرات في اليوم الأول. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط المستهلك ببطء من الآبار باستخدام ماصة دون إزعاج الخلايا الملتصقة بشكل فضفاض.

ثم أضف بعناية أربعة ملليلتر من E GM اثنين إلى الآبار وأعد اللوحة إلى الحاضنة. تظهر المستعمرات عادة بين اليومين الخامس والرابع عشر في اليوم السابق للإجراء. في 50 ميكرولتر من كولاجين ذيل الفئران.

اكتب واحدا لكل بئر من لوحة 96 بئر كما كان من قبل واحتضن اللوحة طوال الليل في يوم الإجراء. ابدأ بغسل الخلايا التي تم تمريرها مرتين إلى ثلاث مرات فقط مرتين باستخدام PBS. بعد شفط الغسيل النهائي ل PBS ، ضع أسطوانة استنساخ معقمة مطلية بالهلام حول كل مستعمرة ، واضغط على كل أسطوانة بقوة على اللوحة باستخدام ملقط معقم.

أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات من E Express الثلاثي الدافئ في كل أسطوانة استنساخ واحتضان الأسطوانات لمدة ثلاث إلى خمس دقائق حتى تبدأ الخلايا في الانفصال. بعد أن تبدأ الخلايا في الانفصال عند حوالي 250 ميكرولتر من EGM ، اثنان متوسطان في وسط الأسطوانة والماصة لأعلى ولأسفل لتوليد تعليق خلية واحدة. الآن قم بنقل تعليق الخلية المفردة من كل أسطوانة استنساخ على حدة إلى أنبوب طرد مركزي صغير فردي.

قم بإصابة الخلايا في صفيحة من ستة آبار باستخدام EGFP التي تعبر عن فيروسات العدسات وجمع الخلايا التي تعبر عن EGFP عن طريق القياس الخلوي الفلوري. ثم احتضان الخلايا الإيجابية EEG FP و EGM اثنين في الألواح المطلية بالكولاجين. عندما تكون مركبات الكربون الكلورية فلورية E جاهزة ، اجمعها باستخدام رحلة E Express كما هو موضح للتو الخلايا و e GM اثنين من التركيز المتوسط إلى النهائي من حوالي 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر.

ثم باستخدام فارز التدفق بمعدل تدفق منخفض يبلغ 20 خلية في الثانية ، قم بفرز ECFC واحد إيجابي جنيه مصري لكل بئر في لوحة البئر المطلية بالكولاجين 96 المعدة مسبقا ، اضبط الحجم النهائي لكل بئر باستخدام EGM من اثنين إلى حوالي 200 ميكرولتر لكل بئر. ثم استخدم مجهر مضان مقلوب للتأكد من أن كل بئر يحتوي على خلية واحدة فقط. احتضن اللوحة على مدى أسبوعين مع تغييرين في الوسائط في اليوم 14 من الثقافة.

اغسل كل بئر ب 100 ميكرولتر من PBS قبل تثبيت الخلايا ب 100 ميكرولتر من الألدهيد 4٪ لمدة 30 دقيقة. بالنسبة لمركبات الكربون الكلورية فلورية التي لا تعبر عن EGFP ، أضف كاشف cyt ، وهي صبغة نووية فلورية خضراء بعد تثبيت الفقرة فورمالديهايد وتحتضن عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. استخدم المجهر الفلوري لتحديد عدد الخلايا البطانية الموسعة بشكل واضح كما هو موضح هنا تعتبر الآبار التي يبلغ عدد الخلايا البطانية من اثنين إلى 50 مجموعات خلايا بطانية.

الآبار التي تحتوي على 51 إلى 2000 خلية هي منخفضة التكاثر ، وتعتبر مركبات الكربون الكلورية فلورية الإلكترونية والآبار التي تحتوي على 2001 أو أكثر من مركبات الكربون الكلورية فلورية عالية التكاثر. بعد فصل الخلايا باستخدام E Express الثلاثي كما كان من قبل ، احصل على عدد خلايا قابل للحياة لثقافة الخلية عن طريق hemo و Cytometer و trian blue. انقل 2.4 مليون خلية قابلة للحياة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، ثم قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي أثناء تدوير الخلايا.

امزج مكونات مصفوفة الجل جيدا ثم اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم مع الحفاظ على المحلول على الثلج. بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بتعليق الحبيبات في 360 ميكرولتر من الدافئ e GM اثنين. ثم أضف 840 ميكرولترا من محلول مصفوفة الجل إلى الخلايا واخلط المحلول بعناية حتى يتم تعليق الخلايا تماما في الجل انقل معلق الجل السلوي سعة 1 مليلتر إلى بئر واحد من لوحة زراعة الأنسجة 12 بئر واحتضان اللوحة حتى يتبلمر الجل.

ثم قبل الحضانة طوال الليل ، قم بتغطية الجل برفق بملليلترين من مخطط كهربية النوم الدافئ مرتين في اليوم التالي وقبل الزرع مباشرة. استخدم مقص القزحية لتشريح الجل إلى قطعتين متساويتين وإعادة قطع الجل إلى نفس الثقافة التي تحتوي على e GM اثنين من المتوسطين. بعد التأكد من التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم ، حلق الجزء السفلي من البطن لإيماءة مخدرة عمرها من خمسة إلى ستة أسابيع ، وانزلق الفأر وتنظيف موقع الجراحة جيدا عن طريق تدوير وسادات الكحول والبيتادين.

بعد ذلك ، استخدم مقص قزحية حاد معقم لعمل شق بطول خمسة ملليمترات تقريبا في الربع السفلي من البطن ، مما يؤدي إلى تعريض المسافة تحت الجلد بين الجلد وعضلة البطن. بلانت. قم بتشريح الطبقة الجلدية من عضلة البطن في منطقتين مختلفتين من البطن لإنشاء جيوب بعرض 15 إلى 20 ملم ، أحدهما يؤدي إلى الربع العلوي من البطن والآخر إلى منطقة أخرى من البطن. ثم رفع الطبقة الجلدية فقط تدلل إلى الشق.

أدخل نصف قطعة من الجل في جيب بطني واحد في نصف قطعة أخرى من الجل في جيب البطن الآخر. بعد إدخال المواد الهلامية ، أغلق كل شق بغرز إلى ثلاث غرزات باستخدام خمس خيوط من مادة البولي بروبيلين على إبرة قطع. قم بتسمية بطاقات القفص وقم بإجراء مراقبة ما بعد الجراحة والتسكين وفقا للمتطلبات المؤسسية والبروتوكولية.

بعد التضحية بالحيوان في اليوم 14 من الزرع ، امسح بطن الفأر بضمادات كحولية وقطع الجلد المدلل إلى خط الشق الأصلي. ثم استئصال اللوحات من الجلد مدللة إلى الموقع المحتمل للمواد الهلامية. يقطع محيطيا حول المواد الهلامية لإزالة كل غرسة ، ثم يضع الغرسات المستأصلة في مثبت الزنك.

باستخدام تقنية اشتقاق ECFC هذه ، لاحظنا نمو تكوين المستعمرة الأولية في وقت مبكر من اليوم الخامس. لاحظ مورفولوجيا الحصى لثقافات ECFC الخمس هذه اليوم كما هو موضح في رؤوس الأسهم. تعبر المستعمرات الموسعة عن مستضدات البطانية ، ولكنها لا تعبر عن مستضدات مكونة للدم.

كما هو موضح في هذا الممثل في تقييم النمط الظاهري في المختبر للخلايا البطانية والمكونة للدم ، كشف التنميط المناعي أن مركبات الكربون الكلورية فلورية e تعبر عن مستضدات بطانية مثل CD 31 و CD 34 و CD 1 44 و CD 1 46 و FL واحد ، ونقرة واحدة ، والوجه الرابع ، و NRP اثنين ، ولكنها لم تعبر عن مستضدات المكونة للدم ، CD 45 CD 14 ، CD 11 BC Kit CXCR four أو CD 1 33. الأهم من ذلك ، كما هو موضح في هذا الرسم البياني الشريطي ، تعرض المستعمرات الموسعة تسلسلا هرميا كاملا لإمكانات التكاثر النسيلي على مستوى الخلية المفردة التي تتراوح من مجموعات من خليتين إلى 50 خلية إلى مستعمرات أكبر من عام 2001. تم الحصول على هذه الصور المجهرية للمستعمرات الملطخة ب cyt ، وهي صبغة نووية فلورية خضراء بعد زراعة مركبات الكربون الكلورية فلورية المشتقة من دم الحبل السري على مستوى الخلية المفردة لمدة 14 يوما.

علاوة على ذلك ، تشكل مركبات الكربون الكلورية فلورية الإلكترونية أوعية دموية متوافقة مع البشر يتم إغراقها بخلايا الدم الحمراء المضيفة عند زرعها في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. في هذا التلوين h و e لمركبات الكربون الإلكترونية المشتقة من دم الحبل السري التي تحتوي على غرسات جل CELLULARIZE ، يمكن ملاحظة الأوعية الدقيقة المملوءة بخلايا الدم الحمراء المضيفة التي تشكلت في هلام الكولاجين فيبرونيكتين بعد 14 يوما من الزرع. هنا ، يؤكد تلطيخ CD 31 المضاد للإنسان باللون البني الأصل البشري لهذه الأوعية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اشتقاق مركبات الكربون الكلورية فلورية الإلكترونية من دم الحبل السري البشري ، وكيفية استنساخ وتوسيع وتوصيف وظائف مستعمرات ECFC بعد تطويرها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في بطانة الأوعية الدموية لاستكشاف إمكانات التكاثر النسيلي البطاني والقدرة الجينية للخلايا البطانية التي يتم الحصول عليها من مصادر متعددة.