التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحقيق متابعة موحدة في السلوك في الجسم الحي للخلايا الجذعية المزروعة في دماغ الفأر. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع العلامات أولا على الخلايا اللحمية المشتقة من نخاع العظام ، والتي شاركت في التعبير عن EGFP و luciferase مع جزيئات أكسيد الحديد بحجم ميكرون الفلورسنت. الخطوة الثانية هي حقن MPIO المسمى BMCs بشكل مناسب في أنسجة دماغ الفأر.

بعد ذلك ، يتم اتباع بقاء الطعوم الخلوية وتوطينها بشكل غير جراحي باستخدام التصوير الحيوي والتصوير بالرنين المغناطيسي. الخطوة الأخيرة هي التحقق من صحة نتائج التصوير في الجسم الحي باستخدام التحليل النسيجي بعد الوفاة. يمكن أن توفر هذه الطرق نظرة ثاقبة لسلوك الخلايا الجذعية بعد زرعها في دماغ الفأر ، ولكن يمكن أيضا تطبيقها على أنظمة أخرى مثل الكائنات الحية النموذجية ودراسات المرض.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات التعامل مع لأن الحقن الوريدي وداخل المخ يصعب إجراؤه ويحتوي على مخاطر معينة لبقاء. لبدء هذا الإجراء ، أضف 75 في 10 إلى جزيئات أكسيد الحديد الستة بحجم ميكرون أزرق جليدي إلى ثقافة الخلايا المتنامية الفرعية. احتضنها لمدة 16 ساعة أخرى للسماح بامتصاص الجسيمات عن طريق الالتقام الخلوي ، ثم اغسل الجزيئات المتبقية.

اسمح للخلايا بالنمو لمدة 24 ساعة إضافية للحصول على طلاقة الخلية والتوزيع المتجانس ل G-B-M-P-I-O. بعد ذلك ، استخدم الفحص المجهري الفلوري للتحقق بصريا من امتصاص الجسيمات عن طريق حساب نسبة الخلايا الموجبة ل EGFP والخلايا الموجبة G-B-M-P-I-O إلى الكمية الإجمالية للخلايا الموجبة EGFP. بعد ذلك ، اغسل خلايا G-B-M-P-I-O ، المسمى BMSC luciferase EGFP مرتين ب 10 ملليلتر.

يعالج PBS الخلايا باستخدام tripsin EDTA ويحصدها بعد ذلك. كافئ ثم اغسل الخلايا وأعد تعليقها بتركيز نهائي 133 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر في PBS. أخيرا ، احتفظ بالخلايا على الجليد حتى الزرع.

في هذا الإجراء ، قم بتخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق لخليط الكيتامين بمعدل 80 ملليغرام لكل كيلوغرام والزيلازين بمعدل 16 ملليغرام لكل كيلوغرام. انتظر لمدة خمس دقائق حتى ينام الفأر ، ثم احلق رأسه للسماح بالتلاعب المعقم. بعد ذلك ، ضع الماوس في إطار تجسيمي ، وقم بتطهير الجلد بالكحول.

بعد ذلك ، ضع مرهما على عينيه لمنع الجفاف. قم بعمل شق في خط الوسط في فروة الرأس لكشف الجمجمة لاستهداف الحصين. احفر ثقبا في الجمجمة بطول ملليمترين خلفيين ومليمترين جانبيين باستخدام نتوءات حفر الأسنان.

في هذه المرحلة ، قم بدوامة تعليق الخلية لفترة وجيزة ، ثم استنشق تعليق الخلية في المحقنة. بعد ذلك ، قم بخفض حقنة الإبرة إلى عمق 2.5 ملم تحت الجافية والسماح بتوازن الضغط لمدة دقيقة واحدة. بعد دقيقة ، اسحب الإبرة إلى موضع ملليمترين تحت الجافية.

ثم قم بحقن ثلاثة ميكرولترات من تعليق الخلية باستخدام مضخة حقن صغيرة آلية بسرعة 0.70 ميكرولتر في الدقيقة. بعد الحقن، انتظر لمدة خمس دقائق إضافية لمنع ارتجاع تعليق الخلية المحقون. بعد ذلك ، اسحب الإبرة ببطء.

بعد ذلك ، قم بتطهير حدود الجلد ، ثم خياطة الجلد. حقن 300 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ تحت الجلد لمنع الجفاف. في النهاية ، ضع الماوس تحت مصباح تسخين للسماح بالتعافي من التخدير لإجراء التصوير الحيوي

قم بتخدير الفأر بمزيج من 3٪ iso والفلور والأكسجين. ثم ضع الماوس في مصور الفوتون. قلل من مستوى التخدير عن طريق ضبط الفلور إلى 1.5٪ بعد ذلك ، حقن د لوسيفر عن طريق الوريد عند 150 ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم.

احصل على صورة لمدة خمس دقائق باستخدام برنامج رؤية الصور. بعد ذلك ، قم بإجراء معالجة الصور باستخدام برنامج M للرؤية الثلاثية وحدد الإشارة المرصودة باستخدام مناطق ثابتة ذات أهمية. لإجراء التصوير بالرنين المغناطيسي ، قم بتخدير الماوس باستخدام 3٪ فلور ISO في خليط من الأكسجين وأكسيد النيتريك.

ثم ضع الماوس في مصفاة نظام 9.4 Tesla MR الأفقي. قلل مستوى التخدير عن طريق ضبط الفلور إلى 1٪ بعد ذلك ، ضع المرهم على عيون الفأر لمنع الجفاف. بعد ذلك ، استخدم مسبار المستقيم لمراقبة درجة حرارة الجسم.

ثم ضع مستشعرا أسفل بطن الماوس لمراقبة معدل التنفس. حافظ على معدل التنفس عند 110 زائد أو ناقص 10 مرات في الدقيقة ، وحافظ على درجة حرارة الجسم ثابتة ضمن نطاق ضيق من 37 زائد أو ناقص 0.5 درجة مئوية. ثم ضع ملف التردد اللاسلكي السطحي أعلى رأس الماوس.

ضع الماوس في منتصف المغناطيس. بعد ذلك ، افتح ParaVision 5.1 ، قم بتعيين معلمات التسلسل وفقا للمخطوطة المصاحبة. ثم احصل على مجموعة من 10 صور صدى دورانية مرجحة T من أجل الحصول على معلومات تشريحية محددة.

صور صدى التدرج المرجح بالنجوم NT من أجل دراسة هجرة الخلايا الجذعية بدقة عادية تبلغ 70 ميكرومتر مربع. في هذه الخطوة ، ضحي بالفأر وقم بإزالة الدماغ. قم بإصلاح أنسجة المخ في درجة حرارة الغرفة في 4٪ بارالديهايد في PBS لمدة ساعتين.

بعد ساعتين. تجفيف أنسجة المخ عن طريق وضعها في تدرجات مختلفة من السكروز عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بتجميد أنسجة المخ باستخدام النيتروجين السائل وتخزين الأنسجة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم تقطيعها عندما تصبح جاهزا.

قسم أنسجة المخ إلى أقسام بسمك 10 ميكرومتر باستخدام ناظم البرد. بعد ذلك ، تحت المجهر الفلوري ، قم بفحص أقسام التبريد غير الملوثة للمضان الأزرق من جزيئات G-B-M-P-I-O والتألق الأخضر من الخلايا التعبيرية عن EGFP. ثم قم بفحص أقسام التبريد غير الملوثة بحثا عن تألق الخلفية الحمراء الخضراء من الخلايا الالتهابية.

ينتج عن إجراء وضع العلامات على MPIO الأزرق الجليدي الموصوف وضع العلامات عالية الكفاءة لخلايا BMSC ، لوسيفيراز EGFP ، والتي يمكن التحقق من صحتها بسهولة عن طريق الفحص المجهري الفلوري. بعد ذلك ، عند تطعيم G-B-M-P-I-O ، المسمى BMSC ، خلايا EGFP لوسيفيراز في الجهاز العصبي المركزي للفئران ، يمكن مراقبة بقاء الكسب غير المشروع الخلوي عن طريق التصوير الحيوي في الجسم الحي بناء على نشاط لوسيفيراز. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن مراقبة التوطين الدقيق للخلايا المطعمة عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي بناء على محتوى الحديد في MPIO الأزرق الجليدي.

أخيرا ، يظهر التحليل النسيجي التحقق من صحة النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق التصوير الحيوي والرنين المغناطيسي. تم تأكيد البقاء على قيد الحياة المستقر من خلال تعبير EGFP مستقر في الوقت المناسب بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التصوير الجزيئي لاستكشاف الأحداث الخلوية والجزيئية بعد زرع الخلايا الجذعية في نماذج حيوانية مختلفة للأمراض التنكسية العصبية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التصوير الجزيئي ، وتطبيق التلألؤ البيولوجي والتصوير بالرنين المغناطيسي ، والتحقق بشكل كاف من صحة النتائج في الجسم الحي باستخدام التقييم النسيجي بعد الوفاة.