تنقية والتصور من Lipopolysaccharide من البكتريا سالبة الجرام بواسطة استخراج مائي، الفينول الساخن

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخراج LPS من البكتيريا سالبة الجرام. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة خمسة ملليلتر للبكتيريا بين عشية وضحاها في وسط مناسب وضبط الثقافة على كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.5. بعد ذلك ، يتم تكوير البكتيريا عن طريق الطرد المركزي الدقيق ويتم تعليق الخلايا في مخزن مؤقت ثلاثي يحتوي على SDS وشعاع أو إيثانول كابتو.

ثم يتم غلي محللات الخلية ومعالجتها بالبروتياز والنوكلياز. أخيرا ، يتم إجراء عمليتي استخراج متتابعتين باستخدام الفينول المائي الساخن وديل الأثير لإزالة الطبقة الزرقاء المائية والاحتفاظ بها بعناية. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر الكمية بالإضافة إلى وجود أو عدم وجود LPS وسلالات البكتيريا ، بالإضافة إلى طريقة طول سلسلة المستضد O من خلال الفصل بواسطة صفحة SDS وتحليلات الدم الغربية مع الأجسام المضادة المحددة ل LPS أو التلوين المباشر للسكريات في الجل.

تتمثل ميزة هذه التقنية مقارنة بمعالجة البروتياز لهيتشكوك وبراون في أن هذه التقنية تؤدي إلى عينات LPS نقية يمكن حلها بشكل أفضل عن طريق صفحة SDS والنشاف الغربي. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لتخليق وتنظيم عديد السكاريد الدهني في VIR في أي بكتيريا سالبة الجرام تقريبا ، بما في ذلك الإشريكية القولونية والسالمونيلا ، بالإضافة إلى الدفاع البيولوجي ومسببات الأمراض الناشئة مثل Ella و Acetobacter على التوالي لزراعة البكتيريا. لاستخراج LPS ، قم بإعداد مزرعة ليلية للبكتيريا سالبة الجرام في خمسة ملليلتر من LB مكمل بالمضادات الحيوية.

إذا لزم الأمر ، قم بزراعة الثقافة طوال الليل في حاضنة اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. استخدم LB لتخفيف الثقافة من واحد إلى 10 ، ثم قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر بناء على النتيجة. قم بإعداد معلق 1.5 ملليلتر للبكتيريا بكثافة بصرية نهائية عند 600 نانومتر 0.5.

بيليه البكتيريا في جهاز طرد مركزي دقيق عند 10 ، 600 مرة جم لمدة 10 دقائق. ثم قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها. لاستخراج LPS ، قم بإعداد المحاليل التالية ، مخزن مؤقت واحد XSDS ، و 4٪ betta me capto ethanol أو BME 4٪ SDS ، و 20٪ جلسرين في 0.1 molar tris HCL pH 6.8 مع قليل من برومو فينول الأزرق و 10 ملليغرام لكل مليلتر من الحمض النووي الريبي والبروتيناز K في الماء المقطر المعقم يعلق.

البكتيريا المحببة في 200 ميكرولتر من مخزن مؤقت واحد XSDS إعادة تعليق الحبيبات تماما عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل. اغلي البكتيريا العالقة ببطء في حمام مائي لمدة 15 دقيقة. ثم اترك المحلول يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

كخطوة اختيارية ، أضف خمسة ميكرولترات من كل من محاليل الحمض النووي الأول والحمض النووي الريبي واحتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أضف 10 ميكرولترات من محلول البروتياز K واحتضان العينات عند 59 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بجانب كل عينة ، أضف 200 ميكرولتر من تريس المثلج ، الفينول المشبع.

أغلق الأغطية بإحكام وقم بتدوير كل أنبوب لمدة خمس إلى 10 ثوان. احتضان العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. دوامة ، قم بتبريدها أحيانا إلى درجة حرارة الغرفة.

ثم تحت غطاء الدخان ، أضف ملليلترا واحدا من درجة حرارة الغرفة ، إيثيل الأثير إلى كل عينة ودوامة لمدة خمس إلى 10 ثوان. الطرد المركزي العينات عند 20 ، 600 مرة G لمدة 10 دقائق وإزالتها بعناية من جهاز الطرد المركزي. استخرج الطبقة الزرقاء السفلية من كل عينة ، وتجنب الطبقة الصافية العليا.

أضف 200 ميكرولتر إضافي من تريس المثلج ، والفينول المشبع ، وكرر الاستخراج لكل أنبوب. أضف 200 ميكرولتر من اثنين من المخزن المؤقت XSDS. افصل خمسة إلى 15 ميكرولترا من كل عينة LPS على ثمانية إلى 15٪ من المواد الهلامية بولي أكريلاميد SDS.

يظهر هنا هلام صفحة SDS بنسبة 12٪ من عينات LPS المحضرة من سلالات مختلفة من منطقة bur cold de losa ، معزولة من عينات البلغم لمرضى التليف الكيسي. تعكس أنماط النطاقات المختلفة الأعداد المختلفة من مستضد O ، والوحدات المتكررة المرتبطة بالسكريات قليلة السكاريد الأساسية. يمكن رؤية عدد مماثل من الوحدات المتكررة في العينات الأولى والسادسة.

لا تنس أن العمل مع فينول داثيل الأثير يمكن أن يكون خطيرا في الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية مثل معطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية ، ويجب إجراء هذه التجارب في غطاء الدخان أثناء محاولة هذا الإجراء. من المهم إجراء عمليات الاستخراج بسرعة حتى لا تفقد العينات أثناء المعالجة. بعد هذا الإجراء ، يجب اتباع النشاف المناعي الغربي أو طرق تصور عديد السكاريد الشحمي بواسطة STR الفضي أو طرق أخرى من أجل تصور الارتباط بين السلالات.