تنقية والتصور من Lipopolysaccharide من البكتريا سالبة الجرام بواسطة استخراج مائي، الفينول الساخن

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخلاص LPS من البكتيريا سالبة الجرام. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زراعة مزرعة بكتيرية بحجم 5 mL طوال الليل في وسط مناسب، وتعديل كثافة المزرعة الضوئية عند 600 nm لتصل إلى 0.5. بعد ذلك، يتم تجميع البكتيريا في شكل كريات عن طريق الطرد المركزي الدقيق، ثم إعادة تعليق الخلايا في محلول منظم من tris يحتوي على SDS و beam أو capto ethanol.

بعد ذلك، يتم غلي نواتج تحلل الخلايا ومعالجتها بالبروتياز والنوكليز. وفي النهاية، يتم إجراء عمليتي استخلاص متتاليتين باستخدام الفينول المائي الساخن وإيثر ثنائي إيثيل، مع إزالة الطبقة المائية الزرقاء بعناية والاحتفاظ بها. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج توضح كمية ووجود أو غياب LPS وسلالات البكتيريا، بالإضافة إلى نمط طول سلسلة مستضد O من خلال الفصل بواسطة SDS page وتحليلات western blood باستخدام أجسام مضادة متخصصة لـ LPS أو التلوين المباشر للسكريات المتعددة في الهلام.

تكمن ميزة هذه التقنية مقارنة بمعالجة البروتياز التي وصفها Hitchcock و Brown في أن هذه التقنية تؤدي إلى الحصول على عينات LPS نقية يمكن فصلها بدقة أكبر بواسطة SDS page واللطخة الغربية (western blotting). ويمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة حول تخليق وتنظيم عديد السكاريد الدهني في VIR في أي بكتيريا سالبة الجرام تقريبًا، بما في ذلك e coli والسالمونيلا، بالإضافة إلى مسببات الأمراض الناشئة وتلك المتعلقة بالدفاع البيولوجي مثل Ella و Acetobacter على التوالي. لزراعة البكتيريا واستخلاص LPS، يتم تحضير مزرعة ليلية من البكتيريا سالبة الجرام في 5 mL من وسط LB المدعم بالمضادات الحيوية.

إذا لزم الأمر، يتم إنماء المزرعة طوال الليل في حاضنة هزازة بسرعة 200 RPM ودرجة حرارة 37 درجة مئوية. استخدم وسط LB لتخفيف المزرعة بنسبة 1 إلى 10، ثم قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر بناءً على النتيجة. قم بتحضير معلق بكتيري بحجم 1.5 ملليلتر بكثافة ضوئية نهائية عند 600 نانومتر تبلغ 0.5.

قم بترسيب البكتيريا باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق عند 10,600 ×g لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة السائل الطافي والتخلص منه. لاستخلاص LPS، قم بتحضير المحاليل التالية: محلول SDS المنظم بتركيز 1X، و4% β-mercaptoethanol أو BME، و4% SDS، و20% glycerol في 0.1 M tris HCL بـ pH 6.8 مع إضافة كمية قليلة من bromo phenol blue، ومحاليل بتركيز 10 mg/mL من DNAse 1 و RNAse و proteinase K في ماء مقطر معقم، ثم أعد تعليق الراسب.

يتم ضمان إعادة تعليق البكتيريا المترسبة بالكامل في 200 µL من منظم SDS بتركيز 1X عن طريق سحب المحلول ودفعه باستخدام الماصة. تُغلى البكتيريا المعلقة ببطء في حمام مائي لمدة 15 دقيقة، ثم يُترك المحلول ليبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

كخطوة اختيارية، أضف 5 µL من كل من محلولي DNA one وRNA، ثم حضّن العينات عند 37 °C لمدة 30 دقيقة. أضف 10 µL من محلول protease K وحضّن العينات عند 59 °C لمدة ثلاث ساعات. أضف بجانب كل عينة 200 µL من tris المشبع بالفينول والمبرد بالثلج.

أغلق الأغطية بإحكام وقم برج كل أنبوب باستخدام جهاز vortex لمدة تتراوح من 5 إلى 10 ثوانٍ. حضّن العينات عند درجة حرارة 65 °C لمدة 15 دقيقة. قم بتبريدها تدريجياً حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة مع الرج باستخدام جهاز vortex من حين لآخر.

بعد ذلك، وتحت خزانة استخلاص الأبخرة، أضف 1 mL من إيثيل إيثر بدرجة حرارة الغرفة إلى كل عينة وقم برجها بجهاز الفورتكس لمدة تتراوح من 5 إلى 10 ثوانٍ. قم بطرد العينات مركزياً عند 20,600 ×g لمدة 10 دقائق ثم أخرجها بعناية من جهاز الطرد المركزي. استخلص الطبقة الزرقاء السفلية من كل عينة، مع تجنب الطبقة الشفافة العلوية.

أضف 200 µL إضافية من محلول tris المبرد بالثلج، والفينول المشبع، وكرر عملية الاستخلاص لكل أنبوب. أضف 200 µL من محلول SDS المنظم بتركيز 2X. افصل ما بين 5 إلى 15 µL من كل عينة LPS على هلامات بولي أكريلاميد SDS بتركيز يتراوح من 8 إلى 15%.

يظهر هنا هلام SDS-PAGE بتركيز 12% لعينات LPS محضرّة من سلالات مختلفة من bur cold area de losa، والتي عُزلت من عينات بلغم لمرضى التليف الكيسي. تعكس أنماط الحزم المختلفة التفاوت في أعداد وحدات مستضد O المتكررة المرتبطة بالسكريات قليلة التعدد الأساسية. ويمكن ملاحظة عدد مماثل من الوحدات المتكررة في العينتين الأولى والسادسة.

لا تنسَ أن العمل باستخدام فينول داتيل إيثر قد يكون خطيراً، لذا يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية، كما يجب إجراء هذه التجارب داخل خزانة استخلاص الغازات (fume hood) عند تنفيذ هذا الإجراء. ومن المهم إجراء عمليات الاستخلاص بسرعة لتجنب فقدان العينات أثناء المعالجة. وبمجرد الانتهاء من هذا الإجراء، يجب إجراء تحليل Western immuno blotting أو استخدام طرق لتصوير السكر المتعدد الدهني (lipo polysaccharide) عن طريق صبغ الفضة (silver STR) أو طرق أخرى من أجل تصور مدى القرابة بين السلالات.