تحديد وعزل بطيئة تقسيم الخلايا في الإنسان عن طريق ورم أرومي دبقي كربوكسي فلوريسئين Succinimidyl استر (CFSE)

يوضح بروتوكول الفيديو هذا كيفية تحديد وعزل الخلايا بطيئة الانقسام في الورم الأرومي الدبقي البشري باستخدام كربوكسي فلوريسين سوكسينيميد إستر CFSE. يتم أولاً تنمية خلايا الورم الأرومي الدبقي باستخدام مقايسة الكرات العصبية. بعد ذلك، يتم تفكيك الكرات الناتجة إلى خلايا مفردة وصبغها باستخدام CFSE.

تُزرع الخلايا المُحمّلة بـ CFSE مرة أخرى. وفي حالة زراعة الكريات العصبية، يتم تفكيك الكريات الناتجة إلى خلايا مفردة وتمريرها عبر جهاز قياس التدفق الخلوي. يتم تحديد وفرز الخلايا سريعة وبطيئة الانقسام بناءً على شدة الفلورة كدالة لانقسام الخلايا.

يُعد التباين في التردد سمة أساسية في السرطان. ويدعم هذا التباين قوة الورم ويمثل عقبة كبيرة أمام تطوير علاج فعال بشكل كامل. لذلك، من الضروري تطوير أدوات ومقايسات لدراسة وفهم هذا التباين الذي يتم تحديده جينياً وظاهرياً ووظيفياً.

نصف في هذا البروتوكول المرئي طريقة قائمة على استخدام flues و I-C-F-S-C. تتيح هذه التقنية تحديد وفصل المجموعات الفرعية الفردية ضمن مستنبت من الخلايا المشتقة من الورم الأرومي الدبقي البشري والتي تمتلك خصائص وظيفية مختلفة، وذلك باستخدام قياس التدفق الخلوي. لقد استخدمنا هذه التقنية لعزل وتوصيف مجموعة ورمية من الخلايا التي تظهر معدل انقسام بطيئاً، وهي خاصية وظيفية ثبت ارتباطها ببداية تكوين الورم في سرطانات Gliomas. يتم إنشاء مستنبت الكرات والحفاظ عليه باستخدام مقايسة الكرات العصبية، والتي تم وصفها في فيديو منفصل على العنوان الظاهر على الشاشة.

عندما تصل كرات الورم الدبقي إلى حجم يتراوح بين 150 إلى 200 ميكرون في القطر، يُزال الوسط الذي يحتوي على الكرات ويُوضع في أنبوب زراعة أنسجة معقم بحجم مناسب، ثم يُجرى له طرد مركزي بسرعة 800 RPM أو 110 G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يتم التخلص من السائل الطافي وإعادة تعليق كتلة الكرات في 1 مل من trypsin EDTA المدفأ مسبقاً، وتُحضن عند درجة حرارة 37 درجة في حمام مائي لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق. ثم يُضاف حجم مساوٍ من مثبطات التربسين مع السحب والضخ اللطيف باستخدام الماصة لتفكيك الكرات.

يتم طرد معلق الخلايا مركزياً مرة أخرى. يُزال الطافي وتُعاد تعليق الخلايا في 1 mL من الوسط الأساسي للخلايا الجذعية العصبية (neurostem cell basal medium). يتم خلط 10 µL من معلق الخلايا المفردة جيداً مع 90 µL من صبغة triam blue، ويُجرى عد الخلايا لكل 1 مليون خلية سيتم صبغها.

يتم تحضير 1 mL من كاشف الصبغ عن طريق إضافة 1 µL من صبغة CFSE بتركيز 5 mM إلى 1 mL من الوسط الأساسي للخلايا الجذعية العصبية للحصول على تركيز صبغ نهائي قدره 5 µM. بعد ذلك، يتم خلط محلول الصبغ جيداً. ثم يتم نقل العدد المطلوب من الخلايا إلى أنبوب منفصل، وتُفصل بالطرد المركزي، ثم يُزال الطافي.

يُضاف بعد ذلك محلول صبغ CFSE إلى الراسب ويُخلط بلطف حتى التجانس، ثم يُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لإيقاف عملية الصبغ. يُضاف من خمسة إلى عشرة أضعاف حجم الوسط الأساسي للخلايا الجذعية العصبية المبرد بالثلج إلى الخلايا المحملة بـ CFSE وتُخلط جيداً. ثم يتم طرد معلق الخلايا مركزياً والتخلص من السائل الطافي.

في هذه المرحلة، يجب أن تظهر طبقة من الخلايا في قاع الأنبوب ذات لون مائل إلى الأخضر، مما يشير إلى نجاح عملية الصبغ. ولإزالة صبغة CFSE الزائدة، يتم إجراء غسلتين إلى ثلاث غسلات عن طريق إعادة تعليق الراسب في 1 mL من الوسط الأساسي للخلايا الجذعية العصبية، ثم الطرد المركزي والتخلص من السائل الطافي.

بعد الغسلة الثالثة، يتم إعادة تعليق الخلايا في 1 ml من الوسط الأساسي للخلايا الجذعية العصبية، ويتم إجراء عد للخلايا كما هو موضح سابقاً لزراعة الخلايا. يتم تدعيم الوسط الكامل للخلايا الجذعية العصبية بـ EGF بتركيز نهائي قدره 20 ng/ml. بعد ذلك، تُضاف الخلايا من المجموعات المحملة وغير المحملة بـ CFSE إلى الأنابيب الخاصة بها للوصول إلى تركيز نهائي قدره 50,000 خلية/ml.

بعد ذلك، يتم خلط معلقات الخلايا جيداً وتوزيعها في دوارق زراعة أنسجة معقمة. ثم يتم وضع ملصقات تعريفية على الدوارق. ويمكن مراقبة الخلايا باستخدام مجهر فلوري للتحقق من صبغ CFSE، ثم توضع في حضانة رطبة عند 37 درجة و 5%CO2 لمدة تتراوح من خمسة إلى 10 أيام.

للتحقق من صبغ CFSE باستخدام قياس التدفق الخلوي، يتم نقل 500,000 خلية من مجموعات التحكم السالبة المحملة وغير المحملة بـ CFSE إلى أنابيب تدفق منفصلة. يتم ضبط جهاز قياس التدفق الخلوي بناءً على تعليمات دليل المستخدم فيما يتعلق بالمعلمات ذات الصلة. أولاً، يتم تشغيل خلايا التحكم غير المحملة وتسجيل الأحداث بناءً على خصائص التشتت الأمامي والجانبي، ومن ثم في مخطط مدرج تكراري يمثل تردد الخلايا مقابل كثافة CFSE، يتم تحديد بوابة مجموعة الخلايا الرئيسية للتحقق من مستوى كثافة فلورة CFSE.

بعد ذلك، يتم تحليل الخلايا المحملة بـ CFSE باستخدام نفس المعايير المستخدمة للخلايا الضابطة، كما هو واضح. وتظهر الخلايا الموجبة لـ CFSE شدة فلورية أعلى بعدة مراتب من الخلايا الضابطة. وعندما تصل كرات الورم الدبقي إلى متوسط حجم يتراوح تقريبًا بين 150 إلى 200 ميكرون في القطر.

يتم تمرير الكرات وتحضير معلق خلوي أحادي من كل من المجموعات المحملة وغير المحملة بـ CFSE كما هو موضح سابقاً. بعد ذلك، يتم إعادة تعليق الخلايا في حجم مناسب من محلول PBS المعقم بتركيز 1×، ويتم إجراء عد للخلايا لاستبعاد الخلايا الميتة أو التالفة. وعند الفرز باستخدام قياس التدفق الخلوي، يُضاف propidium iodide بتركيز 1 µL لكل ml من معلق الخلايا لجمع الخلايا بطيئة الانقسام وسريعة الانقسام.

عند الفرز، يتم تحضير أنبوبين معقمين لزراعة الأنسجة بسعة 15 mL، يحتوي كل منهما على 1 mL من وسط نمو الخلايا الجذعية العصبية الكامل. بعد ذلك، توضع الخلايا على الثلج أثناء نقلها إلى مرفق قياس التدفق الخلوي. أولاً، يتم تمرير معلق الخلايا من مجموعة الخلايا غير المحملة عبر جهاز قياس التدفق الخلوي.

يتم رسم الأحداث بناءً على التشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي لاستبعاد الخلايا الميتة أو التالفة. ثم تُرسم الخلايا بناءً على التشتت الجانبي مقابل تفاعلية PI، ويتم تحديد مجموعة واحدة من الخلايا الحية كـ "المجموعة الأولى". بعد ذلك، يتم اختيار مجموعة خلايا متجانسة من المجموعة الأولى بناءً على خصائص التشتت الأمامي والجانبي وتحديدها كـ "المجموعة الثانية". ثم تُرسم المجموعة الثانية في مخطط تكراري بناءً على تردد الخلايا مقابل شدة CFSE المحددة على مقياس لوغاريتمي باستخدام المعايير واستراتيجية التحديد ذاتها.

يتم تمرير الخلايا المصبوغة بـ CFSE عبر جهاز قياس التدفق الخلوي وتحليلها. بعد ذلك، يتم تحديد الـ 85% السفلى من الخلايا كخلايا سريعة الانقسام، والـ 5% العليا كخلايا بطيئة الانقسام. يتم اختيار هذه المجموعات الخلوية المختلفة ذات الأهمية وفرزها في أنابيب زراعة أنسجة معقمة سعة 15 mil تحتوي على 1 mil من وسط زراعة الخلايا الجذعية العصبية الكامل.

يجب ضبط معدل عتبة الفرز بحيث لا يتجاوز 2,500 حدث في الثانية. بعد الانتهاء من عملية الفرز، يتم إجراء طرد مركزي للخلايا مع التخلص من الطافي وإعادة تعليق الراسب في حجم مناسب من الوسط الزرعي، ثم يتم إجراء عد للخلايا. بعد ذلك، تُزرع الخلايا من المجموعات المختلفة التي تم فرزها بكثافة تبلغ 50,000 خلية لكل ml.

في وسط الخلايا الجذعية العصبية الكامل، والمُدعم بـ 20 nanograms per ML من EGF، يتم تحضين الخلايا لمدة تتراوح من 5 إلى 10 أيام لنمو الكريات. هذا مثال على الخلايا. بعد تحميلها بصبغة CFSE بفترة وجيزة، تظهر جميع الخلايا تألقاً أخضر مكثفاً كما هو موضح تحت مجهر التألق.

هذه صورة لكرة ورم دبقي تمثيلية مشتقة من خلايا محملة بـ A-C-F-S-E بعد ستة أيام من الزرع. يلاحظ أن بعض الخلايا لا تزال تظهر تلوينًا ساطعًا جدًا بـ CFSE. هذا مثال على مدرج تكراري لقياس التدفق الخلوي يوضح أن شدة CFSE تتلاشى بمرور الوقت.

يمثل اللون الأزرق الخلايا التي تم تحميلها حديثاً بـ CFSE، والتي تظهر شدة فلورية أعلى بعدة مراتب من الخلايا غير المحملة الممثلة باللون الأحمر. ويمثل اللون الأخضر شدة الفلورية التي تلاشت على مدى فترة ستة أيام بعد التحميل بـ CFSE نتيجة انقسام الخلايا.

تمثل هذه الكرات الناتجة عن النمو بعد سبعة أيام من عزل المجموعات ذات الانقسام السريع والبطيء. ولا تختلف ترددات تكوين الكرات بين المجموعتين، إلا أن الخلايا التي تحتفظ بـ CFSC تنمو بشكل أبطأ وتنتج كرات أصغر حجماً مقارنة بالخلايا التي تخفف من CFSC. ويعد استخدام CFSC لتحديد وعزل مجموعة فرعية من الخلايا بناءً على معدل انقسام الخلايا نقطة انطلاق للتجارب اللاحقة وللمزيد من التوصيفات.

يوفر هذا البروتوكول مثالاً لتحديد الخلايا بطيئة الانقسام في مستنبت مشتق من الورم الدبقي البشري، ولكن يمكن تطبيقه أيضاً على أنواع أخرى من الخلايا الورمية أو على أنظمة غير سرطانية. نشكركم على المشاهدة ونأمل أن يكون هذا البروتوكول مفيداً لأبحاثكم.