استخدام غير المثبتة، مناديل مجمدة لدراسة التوزيع الطبيعي الميوسين

الهدف العام من التجربة التالية هو الحفاظ على التوزيع الطبيعي لعملية الغليكوزيلة (glycosylation) في المخاط المفرز داخل عينات الأنسجة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تضمين الأنسجة في وسط درجة حرارة القطع المثلى، أو OCT، لتقليل معالجة الأنسجة، ومن ثم السماح بالكشف عن تراكيب الغليكان والميوسين والمخاط. يتم تحضين المقاطع مع أجسام مضادة للّكتينات وأصباغ كيمياء نسيجية.

يمكن اختبار ارتباط الليكتين بشكل أكبر عن طريق التثبيط التنافسي أو التحلل الإنزيمي للحواتم الغليكانية لتأكيد خصوصية ارتباط الليكتين. وفي النهاية، يمكن مقارنة حفظ عينات المخاط والأنسجة المجمدة بحفظ المخاط في العينات المدمجة في البارافين من خلال التحليل الكيميائي الدقيق. وتتمثل المزايا الرئيسية لاستخدام هذه التقنية على الطرق الحالية، مثل دمج الأنسجة في البارافين والتثبيت بمحلول كارنو، في أن هذه الطريقة لا تتطلب استخدام مثبتات متخصصة وتسمح بالاستفادة من الأنسجة المجمدة التي قد تكون موجودة بالفعل في المختبر.

في البداية، اترك النسيج المجمد سريعاً ليرتفع درجة حرارته إلى -20 °C عن طريق وضعه في غرفة الميكروتوم التجميدي. وفي هذه الأثناء، قم بتجهيز حمام تجميد بإضافة ميثيل بوتان إلى صندوق من البوليسترين الرغوي الضحل، ثم أضف الثلج الجاف إلى الصندوق. بعد ذلك، أضف كمية كافية من OCT لتغطية قاع قالب تجميد قابل للنزع، ثم ضع النسيج في القالب.

تأكد من استقرار النسيج على قاع القالب بالاتجاه المطلوب. غطِّ النسيج بمزيد من مركب OCT، ثم ضع القالب في حمام التجميد. سيتحول لون مركب OCT إلى اللون الأبيض أثناءما يتجمد النسيج. وبمجرد التجميد، قم بإزالة القالب عن الكتلة المجمدة وضع الكتلة في كيس تجميد محدد بملصق.

تُحفظ القوالب المجمدة عند درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى وقت الاستخدام قبل تقطيع النسيج. تُوضع القوالب المجمدة المطلوبة في غرفة الميكروتوم إجهادي التجميد (cryo microtome) لمدة 30 دقيقة تقريبًا لتصل درجة حرارتها إلى 20- درجة مئوية. وعندما تكتسب القوالب بعض الدفء، يُقطع مقطع بسمك 3 إلى 5 ميكرومتر، ثم تُوضع شريحة زجاجية مشحونة إيجابيًا فوق المقطع.

ستلتصق الأنسجة بالشريحة بعد تجفيفها في الهواء لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة. يتم تثبيت الشرائح باستخدام فورمالين منظم بتركيز 10% لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم تُغسل الشرائح ثلاث مرات في محلول PB PBS عن طريق غمسها 10 مرات بسرعة في 250 milliliters من المحلول المنظم؛ ولصبغ الأنسجة بـ aum. Blue أولاً، تُشطف الشرائح بالماء ثم تُحضن في حمض أسيتيك بتركيز 3% لمدة ثلاث دقائق.

بعد ذلك، يتم تحضين الأنسجة مع محلول AUM blue. وبعد مرور 30 دقيقة، تُغسل الشرائح تحت تيار من ماء الصنبور لمدة 10 دقائق، ثم تُشطف بالماء منزوع الأيونات (DI water). يتم صبغ الأنوية صبغًا تباينيًا باستخدام صبغة nuclear fast red لمدة خمس دقائق، ثم تُغسل الشرائح ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات (DI water). الآن، يتم تجفيف وتنقية الشرائح عن طريق التحضين لمدة دقيقة واحدة في 95%ethanol، يليه ثلاثة تغييرات سريعة في 100%ethanol، ثم ثلاثة تغييرات في citrus resolve لمدة دقيقتين لكل منها.

أخيراً، قم بتثبيت غطاء شريحة على الشريحة باستخدام وسط رنين مثل cyto seal 60 لصبغ الأنسجة باستخدام حمض البيروديك. أولاً، اشطف الشرائح بالماء ثم حضنها مع حمض البيروديك بتركيز 1% المحضر حديثاً لمدة خمس دقائق. الآن، اغسل الشرائح ثلاث مرات بماء مقطر.

اغمس الشرائح مرة واحدة في ماء Milli Q، ثم صبغ الأنسجة باستخدام كاشف shiff. بعد 15 دقيقة، اغسل الشرائح في ماء الصنبور الجاري لمدة 10 دقائق أخرى، ثم اغمسها مرة واحدة في الماء المقطر (DI water). قم بصبغ الأنوية صبغًا مضادًا باستخدام sgio metin لمدة 30 ثانية، ثم اغسل الشرائح ثلاث مرات بالماء المقطر (DI water).

أخيراً، يتم تحضين الشرائح لمدة 30 ثانية. تُغسل الشرائح ثلاث مرات إضافية في الماء منزوع الأيونات (DI water) باستخدام كاشف التزرقة الخاص بـ Scot's tap water، ثم يتم تجفيف الأنسجة كما هو موضح سابقاً في تلوين الكالسيوم الأزرق. تُثبت الشرائح باستخدام غطاء شريحة للكشف الفلوري عن واصمات الغليكان باستخدام الليكتينات.

أولاً، قم بحجب الشريحة باستخدام BSA في PBS لمدة تتراوح من 10 إلى 30 دقيقة. ثم قم بحجب البيوتين الداخلي عن طريق تحضين الشريحة لمدة 15 دقيقة مع avadon، يليه غسل بـ PBS، ثم تحضين لمدة 15 دقيقة مع 0.01% biotin بعد غسل آخر بـ PBS. ضع الشريحة في صندوق تلوين، وقم بوضع طبقة من خليط مُعد حديثاً من الليكتينات المطلوبة فوق كل مقطع نسيجي، ثم غطِّ خليط الليكتين برفق باستخدام parfum.

الآن، قم بتحضين الشريحة في الظلام لمدة ساعة واحدة. أزل المحلول المانع برفق واغسل الشريحة ثلاث مرات باستخدام PBS. بعد ذلك، قم بتغطية الشريحة بـ strep avid في conjugated SCI five وحضنها في الظلام مرة أخرى لمدة 30 دقيقة، ثم اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS وبعد ذلك قم بصبغ الأنوية متبوعة بـ dappy.

أخيراً، قم بتثبيت الشريحة باستخدام غطاء ساتر وباستخدام وسط مائي مثل vector mount mounting media لمجموعة الضبط الخاصة بإنزيم sase. ابدأ بإضافة الماء إلى قاع صندوق رؤوس ماصات فارغ لتشكيل غرفة رطبة. ضع شرائح الضبط السلبي بحيث يكون الوجه للأعلى على الصينية العلوية لصندوق الرؤوس.

ضع طبقة تتراوح من 150 إلى 200 µL من محلول US على مقاطع الأنسجة، ثم غطِّ كل شريحة بغطاء شريحة، مع تجنب تكوين فقاعات هوائية. أغلق غطاء الصندوق واترك الصندوق في الحاضنة عند 37 °C لمدة ساعتين ونصف. اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي أحماض سيليسيك حرة.

بعد ذلك، تُحضن الشرائح مع SNA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة من أجل التثبيط التنافسي. يتم توزيع كمية ضابطة قدرها 200 microliters من خليط الليكتين على أنبوبين من نوع einor. ثم يُضاف 200 millimolar من مثبط Jacqueline المسمى Meli bios إلى أحد الأنبوبين، ويُضاف مثبط SWGA وهو chitin hydrolysate بتخفيف قدره 1 إلى 10 إلى الأنبوب الآخر.

ثم يتم تحضين الشرائح مع الخلائط المحتوية على المثبط لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في هذا الشكل النسيجي الأول، صُبغت مقاطع من عينات قولون فأر أو دجاج مجمدة في OCT أو مغمورة في البارافين باستخدام حمض البيروديك شيف باللون الوردي أو الكالسيوم بلو باللون الأزرق. وقد كشفت المقارنة بين عينات الأنسجة المغمورة في البارافين والأنسجة المجمدة المغمورة في وسط الحماية من التجمد OCT عن فروق ملحوظة في حفظ وجودة صبغ البروتينات السكرية للموسين في الأنسجة المجمدة.

بالإضافة إلى الميوسين في الخلايا الكأسية، كان المخاط المفرز مرئياً أيضاً كما تشير الأسهم في الأنسجة المضمنة في البارافين. واقتصر تلوين المخاط على الخلايا الكأسية. وفي هذا الشكل، يمكن ملاحظة الفقدان الكبير للميوسين في الأنسجة التي تم تحضينها في citrus resolve.

ثُبِّتت مقاطع متسلسلة من عينات مجمدة من اللفائفي للدجاج في فورمالين منظم بتركيز 10% وحُفظت رطبة، ثم جُففت باستخدام الإيثانول عن طريق الحضن المتتابع في إيثانول بتركيزات 70% و90% و100% لمدة 20 دقيقة لكل تركيز، أو جُففت في الإيثانول ثم نُقيت باستخدام citrus all لمدة ساعة واحدة. وقد أدى التجفيف بالإيثانول وحده، وكذلك التجفيف بالإيثانول المتبوع بالتنقية باستخدام citrus all، إلى تحسين مورفولوجيا الأنسجة. ولم يكن للتجفيف الإضافي بالإيثانول وحده أي تأثير ملحوظ على الصبغة الزرقاء.

في المقابل، أدت جميع عمليات تحضين الحمضيات إلى تقليل الصبغ الأزرق وحصره في الخلايا الكأسية بنمط مشابه لذلك الذي لوحظ في الأنسجة المدمجة في البارافين والموضحة في الشكل السابق. تشير المربعات إلى مناطق التكبير الأعلى في مقاطع أنسجة صبغة الأليوم الزرقاء. وفي هذه السلسلة التالية من الصور، تظهر عينات من لئيمة الدجاج المجمدة في OCT أو المدمجة في البارافين، ثم تم فحصها باستخدام Jacqueline باللون الأزرق، وSWG باللون الأخضر، وSNA باللون الأحمر في الأنسجة المجمدة.

كشف ارتباط Jacqueline بـ olink glycans عن هياكل بدت وكأنها تخرج من الخلايا الكأسية إلى اللمعة، كما هو موضح بالأسهم في مقطع النسيج المجمد بتقنية OCT. وفي المقابل، اقتصر ارتباط Jacqueline في الأنسجة المضمنة في البارافين على الخلايا الكأسية والحدود الفرشاتية للخملات المشار إليها بهذه الأسهم. ويظهر تلوين SWGA لـ beta one four GL تماوضعاً جزئياً مع ارتباط ليكتين Jacqueline في كل من الأنسجة المجمدة والأنسجة المضمنة في البارافين، كما تشير الأسهم.

في المقابل، يرتبط ليكتين SNA الموضح باللون الأحمر ورؤوس الأسهم داخل الخلايا بحمض السياليك المرتبط بـ alpha two six ولا يتوضع بشكل مشترك مع Jacqueline، الموضح باللون الأزرق والأسهم المنقطة في هذا الشكل. تم شطر إيبيتوبات حمض السياليك من عينات اللفائفي للدجاج عن طريق هضم مقطع النسيج باستخدام a US أو تُرِكت دون شطر عن طريق التحضين في منظم خلات الصوديوم كما هو موضح هنا. أدت المعالجة بـ a US إلى إبطال التلوين بـ SNA المبيوتن والذي يُلاحظ في النسيج غير المعالج، مما يؤكد خصوصية ارتباط SNA بأحماض السياليك.

يمكن أيضاً تأكيد خصوصية الليكتين عن طريق إضافة مثبط تنافسي مثل الميليبيوز لصبغة الجاكوتين أو محلل الكيتين لصبغة SWGA. وقد تم تحضين عينات من اللفائفي للدجاج مرة أخرى مع خليط من الجاكوتين وSWGA، ولكن هذه المرة بوجود مثبطات ليكتين محددة، وهي الميليبيوز أو محلل الكيتين. وقد ثبُت أن الميليبيوز قد ثبط صبغة الجاكوتين، بينما لم يفعل محلل الكيتين ذلك. وعلى العكس من ذلك، فقد ثبط محلل الكيتين صبغة SWGA، في حين لم يفعل الميليبيوز.

توضح هذه السلسلة النهائية من الصور أن عينات الأنسجة المجمدة سريعاً، والتي يتم الحصول عليها روتينياً في العيادات ومختبرات الأبحاث، يمكن تضمينها لاحقاً في مركب OCT واستخدامها لدراسة الجليكانات الموجودة على الميوسين، والبروتينات السكرية، والليبيدات السكرية، والجليكانات. لقد تم تجميد هذه الخزعات من سرطان القولون والمستقيم المأخوذة من أنسجة السرطان الزغبي والسرطان المخاطي سريعاً في النيتروجين السائل ثم ضُمنت في مركب OCT، وصُبغت بنجاح للكشف عن مختلف epitopes الميوسين والجليكان الموضحة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تضمين الأنسجة في مركب OCT وكيفية تحليل عملية glycosylation للمخاط والأنسجة باستخدام الطرق المناعية الكيميائية.