Electroantennographic الأحيائي كأداة فحص لمواد متطايرة النبات المضيف

يتمثل الهدف العام من هذا الإجراء في الفحص السريع لعدد كبير من المواد المتطايرة في النباتات العائلة للكشف عن أي نشاط بيولوجي محتمل. ويتحقق ذلك أولاً عن طريق جمع المواد المتطايرة للنباتات العائلة المستهدفة وتحليلها باستخدام GCMS، ثم يتم تحديد المكونات الكيميائية والتحقق منها.

تتمثل الخطوة الثالثة في فحص المكونات الفردية في مكررات كافية للتحقق من النشاط الحيوي عبر التحليل الكهربائي. أما الخطوة النهائية فهي صياغة وتقييم مخاليط من المكونات النشطة. وفي نهاية المطاف، يمكن أن توفر النتائج سلسلة مختصرة من المكونات أو مزيجاً من المكونات الجاهزة لمزيد من الاستقصاء في الدراسات السلوكية على الحشرة المستهدفة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الدراسات السلوكية التي تستغرق وقتاً طويلاً، في أن الفرز السريع عن طريق التحليل الكهربي يقلل بشكل كبير من عدد المركبات التي يلزم إدراجها في دراسات أخرى لإثبات الإجراء. هل السيد MR Wage فني في مختبري؟ وبمجرد تحديد المواد المتطايرة ذات الصلة بواسطة تحليل الكروماتوغرافيا الغازية ومطياف الكتلة، يمكن إجراء تحليل التصوير الكهربي أو EAG لكل مادة متطايرة متاحة أولاً.

ومع ذلك، يجب تحضير المواد المتطايرة المتاحة. قم بتحضير محلول من كل مادة متطايرة في البنتان بتركيز 5 mg/mL في حاوية يمكن إغلاقها بإحكام وتخزينها عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، قم بتحضير ماصات التحفيز.

قم بوضع علامات على 10 ماصات باستير لكل مادة متطايرة ولف أطرافها بقطعة صغيرة من شريط البارافيلم. وتعتبر 10 ماصات كافية لإيصال المادة المتطايرة إلى كل جنس في مسح أولي بعدد مكررات منخفض. الآن قم بمحاذاة المجموعة المتبقية المكونة من خمس ماصات في حامل رف وضع قرص مقايسة حيوية في الطرف المفتوح لكل ماصة.

قم بطي القرص برفق باستخدام ملقط ووضعه جزئياً في الطرف العريض للماصة بحيث يبرز منه مليمتران إلى ثلاثة مليمترات. باستخدام أداة ماصة أو حقنة، قم بتحميل 10 µL من المحلول المتطاير على كل قرص. من المهم للغاية حساب المحاليل وصياغتها وتحضيرها بشكل صحيح لضمان اتساق المكررات.

انتظر مرور دقيقتين، ثم ادفع الأقراص بالكامل داخل الماصات الخاصة بها. وبمجرد تحميلها، قم بإغلاق كل ماصة على الفور باستخدام param. كرر عملية تحضير الماصات هذه للعدد المطلوب من المكررات.

باستخدام البروتوكول ذاته، قم بتحضير ضابط سلبي يتكون من البنتانات فقط، وضوابط إيجابية، وهي في هذه الحالة الأسيتوفينون والهرمون الجنسي. انتقل الآن إلى تحضير قرون استشعار الحشرة.

في هذه التجربة، يقوم مضخم أولي بنقل الإشارة من قطب شوكي إلى جهاز استحصال تخطيط كهربي العضلات (EAG). يجب تهيئة البرنامج المرفق مع جهاز EAG بشكل مناسب داخل البرنامج. قم بضبط الإعدادات عن طريق تعيين معدل أخذ العينات أولاً على 106.7.

قم بضبط مفتاح التبديل الخاص بالتقويم (rectify) على "know" واضبط المرشح (filter) من 0 إلى 42 hertz ضمن علامة تبويب المرشح. قم بتفعيل مرشح EAG واضبط حد القطع المنخفض (low cutoff) على 0.1 hertz. ثم احفظ الإعدادات في ملف تكوين لاستخدامها مستقبلاً.

تصبح عملية تشغيل البرنامج بعد ذلك بسيطة مثل فتح ملف مشروع جديد، وحفظه باسم محدد، ثم البدء في التسجيل. تبدأ أيقونة المثلث الأحمر عملية التسجيل وتظل مفعلة لفترة زمنية محددة مسبقاً لكل نفخة فردية. وعند الانتهاء من جميع النفخات لقرون الاستشعار، تقوم أيقونة X السوداء بإيقاف التسجيل لجعل استجابات EAG أسهل في القراءة بدقة.

يمكن لصق مسطرة صغيرة على شاشة الكمبيوتر عند خط الأساس للإشارة. يتم تسجيل الاستجابة بالمليمترات ثم تحويلها لاحقاً إلى سعة بالميكروفولت. وإذا لزم الأمر، يمكن إعادة تشغيل التسجيلات لإجراء مزيد من التقييم.

في هذا المثال، تم استخدام فراشات برتقال نافال (naval orange) ذكور وإناث متزاوجة تتراوح أعمارها بين ثلاثة إلى أربعة أيام. ومع ذلك، يمكن تطويع هذا البروتوكول ليناسب حشرات أخرى. انقل كل حشرة إلى حاوية بلاستيكية صغيرة ذات غطاء.

في يوم التحليل، وقبل إجراء المقايسة الحيوية مباشرةً، ضع الحشرة في الفتحة الكبيرة لرأس ماصة، والتي تحتوي على فتحة أصغر تكون كافية فقط لمرور رأس الحشرة. بعد ذلك، وباستخدام رأس ماصة أصغر، ادفع الحشرة بعناية نحو الفتحة الأصغر حتى يبرز رأسها تحت المجهر التشريحي (stereoscope). تأكد من تثبيت قرون الاستشعار داخل أنبوب التثبيت مع كشف قواعد قرون الاستشعار لإتمام عملية الاستئصال.

بعد ذلك، قم بوضع حامل الشوكة الذي يحتوي على طبقة رقيقة من جل الأقطاب الكهربائية على مقربة من قرن الاستشعار، وباستخدام مقص دقيق قم بفصل ثم استئصال كلا قرني الاستشعار، وابدأ بتشغيل مؤقت لتسجيل الوقت المنقضي بين هذا الإجراء وبدء المحفزات اللاحقة. وباستخدام أداة ذات طرف سلكي عليها كمية صغيرة من الجل في نهايتها، التقط أحد قرني الاستشعار وضعه على الشوكة. تأكد من وضع قاعدة قرن الاستشعار على القطب الأرضي المحايد (غير الأحمر) في الشوكة.

كرر نفس الخطوات مع الهوائي الثاني. ضع قاعدة الهوائي على نفس جانب الشوكة، بحيث تكون هناك مسافة من اثنين إلى ثلاثة مليمترات بين الهوائيين عند تثبيتهما. قم بقص أطراف الهوائي حسب الحاجة.

ضع الجل على القطب الكهربائي باستخدام فرشاة وتأكد من غمر قاعدته وطرفه في جل القطب الكهربائي بحيث لا توجد فقاعات في الجل. تجنب تغطية الجزء المركزي من الهوائي بالجل لزيادة مساحة سطح الهوائي المعرضة لنفثة المواد المتطايرة. بمجرد الانتهاء من عملية وضع الجل بشكل صحيح، قم بتوصيل الشوكة بمضخم القبلِي للمجس.

قم الآن بتمرير تدفق من الهواء المرطب فوق التحضير للحفاظ على حيوية تحضير قرن الاستشعار. وبعد مرور 10 دقائق من وقت الاستئصال، ابدأ في تطبيق المحفزات الأولى. يبدأ ترتيب عمليات تحفيز التحضير وينتهي بضابط موجب، وبينهما يتم التحفيز بتسلسل عشوائي من المركبات بحيث لا تتكرر نفس المركبات بشكل متتالي، مع وجود ضابط سالب واحد على الأقل، ويختلف عدد المركبات التي يتم إيصالها إلى قرن الاستشعار حسب النوع.

يمكن أن تظل تحضيرة عثة دودة البرتقال البحرية نشطة لأكثر من 30 دقيقة، مما يسمح بتحليل ما يصل إلى 10 مواد متطايرة بسهولة بعدد مكررات منخفض. ينطبق مبدأ توصيل العينات نفسه على عمليات الفحص اللاحقة للمركبات الممزوجة التي تبين أنها تثير استجابات في الفحص الأولي. يجب تحضير ماصة المحفزات الأولى قبل 30 ثانية من تطبيق النفخة؛ قم بفك سدادة الماصة وضعها في الحامل بحيث توجه تدفق الهواء على مسافة تتراوح بين 2 إلى 3 ملم من قرون الاستشعار، وذلك بعد 10 دقائق من عملية استئصال قرن الاستشعار.

قم بتسليم نفخة التحفيز الأولى على مدار ثانية إلى ثانيتين بمعدل 300 milliliters per minute. والآن، استبدل الماصة بسرعة بحيث يتم تسليم التحفيز الثاني بعد دقيقة واحدة من التحفيز الأول. إن تحقيق الاتساق بين العينات سيقلل من التباين في كميات المواد المتطايرة التي يتم نفخها فعلياً.

بعد إعطاء نفخة التحكم الإيجابي النهائية، قم بإزالة الهوائي وتنظيف الشوكة. باستخدام منديل مشبع بالإيثانول، اتركها تجف تماماً قبل الاستخدام اللاحق. لزيادة إنتاجية المقايسات، يجب على المساعد تحضير الهوائي التالي بشوك نظيفة قبل 10 دقائق من انتهاء التحضيرات السابقة.

تسلسل الاختبار، يتطلب هذا الأسلوب استخدام أكثر من شوكة واحدة. بعد كل تجربة، يتم قتل فراشات الاختبار رحمانياً في بيئة من الثلج الجاف وتشريح الفراشات الإناث للتحقق من حالة التزاوج. يُفترض أن الذكور التي تعايشت معها قد تزاوجت، وقد تم تحفيز تحضيرات قرن استشعار دودة البرتقال السري (naval orange worm antenna) بنفخات مدتها ثانيتان، وأُجريت تسجيلات لمدة عشر ثوانٍ مع نافذة زمنية قدرها عشر ثوانٍ على مقياس 5 mV.

كان الانحراف السلبي هو الاستجابة النموذجية. ومع ذلك، تم تسجيل القيم المطلقة. كما تم استبعاد جميع تحضيرات الإناث التي أظهرت استجابة ضعيفة للمجموعة الضابطة الموجبة.

كان متوسط استجابة التحضيرات المتبقية 2,600 microvolts. وبالمثل، كان متوسط استجابة الذكور لمجموعة التحكم في pH الجنس عادةً 3000 microvolts. وبالتالي، تم استبعاد العينات التي أظهرت استجابة دون المستوى المطلوب، كما تم استبعاد البيانات الواردة من قرون الاستشعار التي أظهرت تدهوراً في الاستجابة خلال التجربة.

حدث التحلل إذا كانت استجابة جهاز Anton لنفخة التحكم الإيجابي النهائي أقل من 75% من نفخة التحكم المسبق الأولى، أو أقل من نفخة التحكم المسبق الثانية في بقية التشغيلات التجريبية. تم تحليل قيم الاستجابة عن طريق أخذ القياسات الخام من كل تشغيلة وطرح استجابة التحكم السلبي لتلك التشغيلة من كل قيمة فيها. بعد ذلك، تم حساب متوسط جميع الضوابط الإيجابية في كل تشغيلة وتصحيحها لتصبح 1000 Microvolts، مع تدوين نسبة التصحيح إلى 1000 microvolts لكل تشغيلة.

ثم ضُربت قيم المركبات المختبرة في نسبة تصحيح الضابط الموجب. وأخيراً، تمت مقارنة متوسط الاستجابة المصححة لكل مركب مختبر عبر جميع التشغيلات لتقييم مدى ملاءمة كل مركب لمزيد من الاستقصاء. لا تنسَ أن العمل مع المواد الكيميائية يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات المناسبة.