تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

يستخدم هذا البروتوكول التفاعل بين فيروس شلل الأطفال وفيروس شلل الأطفال ، والتعرف على الأجسام النانوية لإظهار مقايسة التقاط تقارب الطور السائل الكمي البسيط. تستخدم الخرزات المغناطيسية المطلية بالكوبالت بشكل أساسي لسحب البروتينات الموسومة بالإضافة إلى أي بروتينات متفاعلة تحمل علامة راديو. أولا ، امزج البروتينات المصنفة والموسمة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة.

ثم أضف حبات مغناطيسية تتعرف على العلامة ، وتفصل الجزء المرتبط من البروتين المسمى عن الكسر غير المرتبط باستخدام المغناطيس. ثم قم بقياس إشارة البروتين المسمى الموجود في الجزء غير المرتبط وحدد كمية البروتين المسمى الموجود في الجزء غير المرتبط. تعتبر نتائج مقايسة تقارب الطور السائل مفيدة للغاية عند فحص البروتينات الحساسة للتحويل التأكيدي.

يمكن أن يوفر اختبار التقاط تقارب الطور السائل نظرة ثاقبة للتفاعل بين فيروس شلل الأطفال ، والتعرف على النانو بويز ومستضدات فيروس شلل الأطفال المختلفة. يمكن أيضا تطبيق الطريقة على تفاعلات بروتين البروتين الأخرى بشرط أن يتم تسمية بروتين واحد ويمكن اكتشاف الآخر. كان لدينا معرف لهذه الطرق لأول مرة عندما كنا مهتمين بالتحقيق في التفاعل بين فيروس شلل الأطفال ، والتعرف على الأجسام النانوية ومستضدات فيروس شلل الأطفال المختلفة.

وبما أن فيروس شلل الأطفال حساس للتحويل التأكيدي، فإن استخدام eLSA يكون محدودا عند توصيله بسطح صلب. لذلك يجب تفضيل النظام القائم على الطور السائل. مثال على هذا النظام القائم على الطور السائل الذي غالبا ما يستخدم في أبحاث فيروس شلل الأطفال هو البروتين الدقيق.

مقايسة الترسيب المناعي. على الرغم من أن هذا الاختبار أثبت قابليته للتطبيق ، إلا أنه يتطلب بنية متبلورة للجسم المضاد التقليدي ، وهو غائب في الأجسام النانوية. يمكن هندسة هذه الأجسام النانوية ، وهي أجسام مضادة أحادية المجال مثيرة للاهتمام ومستقرة للغاية ، بسهولة باستخدام نصوص مختلفة.

المستخدمة على نطاق واسع. يظهر المكدس تقاربا مع الأيونات ثنائية التكافؤ ، مثل النيكل والكوبالت ، والتي بدورها يمكن تغليفها بسهولة على الخرز المغناطيسي. لذلك قمنا بتطوير مقايسة التقاط التقارب الكمي البسيطة بناء على الخرز المغناطيسي المطلي بالكوبالت.

ريس مخزون من الخرز المغناطيسي عن طريق الدوامة ونقل 10 ميكرولتر لكل عينة إلى أنبوب بيليه الخرز باستخدام مغناطيس. قم بإزالة supinate الشفاف لغسل الخرز. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم.

احصد الخرزات باستخدام مغناطيس وقم بإزالة supinate بعد الغسيل الثاني. أعد تعليق الخرزات في 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم لكل عينة للتحكم فيها. بالنسبة للخلفية في العينة الأولى ، قم بإعداد بئر بدون فيروس مسمى بالإشعاع ، ولكن حجم متساو من المخزن المؤقت الملزم للتحكم.

عينة اثنين من نشاط الراديو بنسبة 100٪. أضف جميع المكونات إلى بئر باستثناء استبدال جسم النانو بمخزن مؤقت ملزم. أضف الآن 2000 عدد في الدقيقة من S 35 المسمى فيروس شلل الأطفال سبع سلالات من النوع الأول في حجم إجمالي قدره 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت الملزم لجميع العينات.

قبول السيطرة. عينة واحدة. أضف 10 ميكرولتر من تخفيف الجسم النانوي إلى كل عينة.

اخلطي جيدا لمدة 10 ثوان على شاكر واحتضنيه لمدة ساعة واحدة من درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولترا من تعليق الخرزة المغناطيسية المغسولة واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة تحت الاهتزاز المستمر ، وحبيبات الخرز بمغناطيس ونقل SUP natant الذي تم تطهيره إلى أنبوب لقياس النشاط الإشعاعي لكل عينة ، ونقل 50 ميكرولترا من supinate إلى قارورة عد. أضف ثلاثة ملليلتر من مزيج سائل التلألؤ واقرأ على هذا العزل.

اسحب الخرز المغناطيسي المستخدم في أنبوب باستخدام الماء وجهاز الطرد المركزي 500 مرة G لمدة دقيقتين. تخلص من supinate وأعد تعليق الخرزات في ستة ملليلتر من 0.5 مولي هيدروكسيد الصوديوم. ثم قم بتقسيم التعليق إلى أنابيب متعددة واحتضانه في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة خمس دقائق.

بعد تكوير الخرزات بمغناطيس وإزالة supinate ، أضف ملليلتر واحد من محلول SDS بنسبة 2٪ إلى كل أنبوب ، ثم خلطه عن طريق الدوامة والرقائق لمدة خمس دقائق. الآن ، حصاد الخرز. أضف ملليلترا واحدا من 0.2 مولار EDTA درجة الحموضة سبعة إلى كل أنبوب ، واحتضن الأنابيب في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة خمس دقائق.

ثم اجمع الخرزات ، واغسل الخرزات بمليلتر واحد من الماء ثلاث مرات متبوعا بمليلتر واحد من محلول كلوريد الكوبالت 10 ملليمول. ضع الأنابيب على شاكر لمدة 10 دقائق. المضي قدما في حصاد الخرز على المغناطيس وتعليق الإعادة في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت الملزم.

اغسل مرتين في ملليلتر واحد من 20٪ من الإيثانول أخيرا قم بتعليق الخرز في حجمها الأصلي البالغ 20٪ من الإيثانول للحصول على حبات متجددة بتركيز 40 ملليغرام لكل مليلتر. تصحيح النشاط الإشعاعي في الخلفية عن طريق ضبط التحكم. عينة واحدة كقيمة النشاط الإشعاعي 0٪ وعينة التحكم الثانية كقيمة النشاط الإشعاعي 100٪.

الآن لكل عينة ، احسب النسبة المئوية للنشاط الإشعاعي في المنطقة كمقياس لإجمالي هطول الأمطار للفيروس الراديوي المسمى بواسطة جسم النانو. تقوم هذه التجربة بتقييم تقارب PVSS 38 C والأجسام المضادة الخاصة بفيروس شلل الأطفال باستخدام ثلاثة مستضدات مختلفة من فيروس شلل الأطفال ، والمستضد الأصلي ، والمستضد الساخن ، والوحدات الفرعية 14 ثانية. ومن المثير للاهتمام ، أن النشاط الإشعاعي في مجموعة العينات التي تحتوي على وحدات فرعية 14 ثانية تسمى الراديو يتناقص مع زيادة تركيزات الجسم النانوي PVSS 38 C ، وهذا يشير إلى زيادة في كمية الوحدات الفرعية لفيروس شلل الأطفال 14 ثانية متصلة بجسم النانو P pvs ، S 38 C ، وبشكل غير مباشر بالخرز المغناطيسي.

نظرا لعدم ملاحظة تقارب المركبات الكهروضوئية S 38 C مع المستضد N والشكل المستضد H لفيروس شلل الأطفال ، يبدو الجسم النانوي محددا للوحدة الفرعية 14 ثانية من فيروس شلل الأطفال. إن تقارب الجسم النانوي تجاه مستضداته كما تم قياسه بهذه الطريقة محدد مثل الجسم النانوي غير ذي الصلة. لا يظهر ملحوظة واحدة أي تفاعل ضد الأشكال المستضدية الثلاثة لفيروس شلل الأطفال.

ينتج هذا النظام قابلية عالية للتكرار كما هو موضح في منحنى استجابة الجرعة هذا الذي تم إنشاؤه بواسطة محققين مختلفين في أيام مختلفة. بمجرد إتقان هذه المرحلة السائلة الموثوقة ، يمكن إجراء مقايسة التقاط التقارب بشكل صحيح في غضون ساعتين من إعادة تدوير الإيقاعات المضمنة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام مقايسة التقاط تقارب الطور السائل بناء على النبضات المغناطيسية عند دراسة التفاعل بين البروتينات المختلفة ، خاصة عندما لا يمكن استخدام الأنظمة القائمة على الطور الصلب.