إزالة الخلايا الليفية السريع من الكثافة البشرية العالية الجنينية الخلايا الجذعية الثقافات

الهدف العام من التجربة التالية هو عزل مستعمرات الخلايا الجذعية البشرية بطريقة سريعة وفعالة. ويتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا الجنينية البشرية فوق طبقة كثيفة من الخلايا الليفية الجنينية للفأر. ومع مرور الوقت، يؤدي تمدد مجتمع الخلايا الجذعية إلى زيادة عدد الخلايا الجذعية البشرية، كما يسمح لها بتكوين مستعمرات تشبه الجزر في الوسط.

بعد ذلك، تتم إزالة طبقة الميثيل ميثاكريلات (meth) عن طريق الشفط، مما يترك المستعمرات الفردية للخلايا الجذعية الجنينية البشرية. وتظهر نتائج الصبغ الكيميائي النسيجي المناعي لعلامات الخلايا الجذعية أن هذه الطريقة فعالة في العزل للتخلص من الخلايا المغذية والحفاظ على سلامة المستعمرات. لقد خطرت لي الفكرة الأولى لهذه الطريقة أثناء الزراعة المشتركة للخلايا في مختبرنا، حيث أردت إنقاذ مستنبتات الخلايا الجذعية من أنظمة الزراعة شديدة التكدس.

لذلك، فإن المشكلة التي سيواجهها معظم الأشخاص عند استخدام هذا النظام هي نقص الخبرة في زراعة الخلايا الجذعية البشرية. لقد وجدنا هذه التقنية مفيدة بشكل خاص عندما نحتاج إلى عزل أعداد كبيرة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لإجراء التجارب، ومقارنةً بالطرق الأخرى مثل الفرز أو الاختيار اليدوي لمستعمرات الخلايا الجذعية، فإن هذه الطريقة أسرع وأكثر كفاءة لعزل المستعمرات من المزارع عالية الكثافة.

يجب معالجة الخلايا الليفية الجنينية للفأر باستخدام الميتومايسين C أو تعريضها للإشعاع قبل الاستزراع المشترك مع الخلايا الجذعية الجنينية لمنعها من الانقسام. قبل ساعتين من استزراع خلايا mEF، يتم طلاء كل طبق استزراع معالج بالبلازما مقاس 60 ملم بـ 2 mL من الجيلاتين بتركيز 0.05%. يتم إذابة قارورة من خلايا mEF المعالجة، ثم يتم إجراء عملية الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 1,500 RPM، ويتم استزراع كثافة خلوية تبلغ حوالي 20,000 خلية/cm² على الطبق المطلي بالجيلاتين. تُحضن المزارع طوال الليل لضمان التصاق الخلايا. يمكن بدء مزارع جديدة من خلايا محفوظة بالتبريد أو عن طريق نقل المزارع الحالية إلى أطباق مطلية بـ mEF. عند البدء باستخدام طبق يحتوي على مستعمرات كبيرة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، يتم الغسل مرة واحدة باستخدام 3 mL من محلول الفوسفات المنظم للملحي الدافئ.

أضف ثلاثة مللي لتر من محلول كولاجينيز 4 بتركيز واحد ملليجرام لكل مللي لتر، واتركه في الحاضنة لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. لن تصبح الخلايا منفصلة أو تتكتل على شكل كرات كما يحدث عند استخدام التريبسين. وباستخدام حافة رأس ماصة سعة خمسة مللي لتر، اصنع نمطاً شبكياً على المستعمرات لتفتيتها إلى تجمعات خلوية صغيرة.

مع تثبيت طرف الماصة بزاوية عمودية على طبق الزرع، قم بكشط قاع طبق الزرع لإزاحة جميع الخلايا من السطح. انقل الخلايا إلى أنبوب فالكون لحصادها، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة خمس دقائق واشفط الوسط. بعد ذلك، اشفط الوسط من الأرومات الليفية الجنينية للفئران التي تم زرعها في اليوم السابق.

بعد ذلك، يتم توزيع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في أطباق بنسبة واحد إلى ثلاثة من الطبق الأصلي، وتغذيتها بـ 3 mL من وسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. تُزرع خلايا HECS البشرية بكثافة عالية لمدة تتراوح بين 10 إلى 14 يوماً. ضع طرف ماصة الشفط عند حافة الطبق واستخدم قوة الشفط لسحب حافة طبقة الميثيل سيلولوز بلطف.

قم بإزالة الوسط من الطبق. اسمح لطرف الماصة بالتقاط الصفيحة الخلوية، ثم حرك الطرف ببطء في شكل قوس فوق الطبق. إذا تسببت الصفيحة في سد الماصة بشكل كبير، فقم بإزالة الصفيحة من المزرعة.

انقر على الجزء العلوي من طبق الزرع باستخدام الشفاط لإكمال عملية تفكيك الخلايا، ثم قم بإزالة الخلايا عن طريق الشفط الكامل. استبدل وسط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية على الفور، وأعد المزرعة إلى حاضنة زراعة الخلايا بعد استزراعها في أطباق الزرع. ينتج عن نظام الزراعة المشتركة هذا مستعمرات عالية الكثافة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية محاطة بأرومات ليفية جنينية فأرية.

تعمل تقنية الشفط على إزالة الـ MES وإنتاج مستعمرات صغيرة وغير مضطربة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. ومع وجود كمية قليلة جداً من الـ mes المحيطة بالمستعمرة السليمة، تتمكن مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية من التوسع بشكل كبير لتصبح مستعمرات ضخمة جداً. على سبيل المثال، توسعت مستعمرة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الموضحة مباشرة بعد استنزاف الـ meth إلى مستعمرة ضخمة جداً، وهو ما ظهر من خلال تحديد المستعمرات بالفلورة المناعية حتى 10 أيام بعد الـ meth.

يُظهر الاستنزاف أن المستعمرات تحافظ على تعبيرها عن علامات تعدد القدرات ولا تظهر تمايزاً نحو المصير الميزوديرمي. تعرض صور الضوء النافذ هذه مورفولوجيا المستعمرات المصبوغة بالفلورة المناعية بتكبيرات مختلفة. يصبغ DAPI نوى الخلايا.

ومن المهم ملاحظة أن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية تعبر عن مؤشرات الخلايا الجذعية البشرية SSEA-4 و Tra-1-6 และ TRA-1-81. لاحظ أن الصور تظهر مستعمرة تتميز بحدود ملساء نموذجية. كما أنها لا تعبر عن FLK-1، وهو مؤشر مبكر لتمايز الأديم المتوسط، ولم تحتوي على أي أرومات ليفية كما يتضح من غياب صبغ DDR2.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية عزل مستعمرات الخلايا الجذعية البشرية باستخدام تقنيات الزراعة للتلاعب بالبيئات الطبيعية. وبعد إتقان ذلك، يمكن القيام بهذه العملية في غضون ثوانٍ. أيضاً، تذكر ألا تترك المزارع تجف عند إزالة الوسط والطبقات العالقة.