جرذ الاهتمام لأمور ظاهرية مساريق: نموذج للتحقيق في حيوية الخلوي شارك في الأوعية الدموية

الهدف من التجربة التالية هو تحديد الديناميكيات الخلوية المكانية والزمانية المشاركة في عملية تكوّن الأوعية الدموية، والتي تُعرف بأنها نمو أوعية دموية جديدة من أوعية موجودة مسبقاً. باستخدام نموذج بسيط وقابل للتكرار، يتم أولاً تحفيز تكوّن الأوعية الدموية عن طريق إخراج مساريق الجرذ لفترة وجيزة، ثم جمع أنسجة مساريقية في نقاط زمنية مختلفة بعد التحفيز. بعد ذلك، يتم وسم المقاطع النسيجية مناعياً.

على سبيل المثال، استخدم واسمًا للخلايا البطانية لتصوير كامل الأوعية الدموية التي تخضع لإعادة التشكيل داخل النسيج، وإنشاء تصور ثنائي الأبعاد أساسي لشبكات الأوعية الدموية الدقيقة النامية. ويعد هذا النموذج جذابًا لأنه يؤدي إلى زيادة ملحوظة في مقاييس تكوين أوعية دموية متعددة خلال فترة زمنية قصيرة نسبيًا عند النظر إليها مجتمعة. وقد ثبت أن تصوير الشبكات على مستوى الخلية الواحدة وربط هذه المقاييس بترميز متعدد الخلايا مفيد للغاية في تحديد أنماط ظاهرة خلوية جديدة تتضمن تبرعم الشعيرات الدموية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية تتعلق بالديناميكيات الخلوية المشاركة في نمو الشبكة الوعائية الدقيقة. وتشمل هذه الأسئلة تحديد متى وأين تتواجد خلايا معينة خلال عملية تنبت الشعيرات الدموية. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه الطريقة في بساطتها، وتطلبها لتدخل جراحي أدنى، وإنتاجها لاستجابة وعائية قوية خلال فترة زمنية قصيرة نسبياً.

بالإضافة إلى ذلك، تستفيد هذه الطريقة من المساريق الظهرية (rap mesentery)، وهي نسيج يسمح بمراقبة شبكة سليمة وصولاً إلى مستوى الخلية الواحدة. وبناءً على خبرتنا، فإن هذه العملية سهلة التعلم للغاية وبالتالي يمكن تكرارها من قبل باحث لآخر، وهو ما سنوضحه من خلال استعراض الإجراء. سيكون معنا اليوم بيتر ستابلر، وهو طالب دراسات عليا في مختبرنا، حيث سيقوم بالتحضير للجراحة كما هو موضح بالتفصيل في النص المرفق.

بعد حلاقة منطقة بطن الجرذ، ضع الجرذ المخدر على ظهره فوق وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم، ثم نظف منطقة البطن بمسحات متبادلة من شاش معقم (GREs) مغموس في كحول الإيزوبروبيل بتركيز 70% واليود. على بعد بوصة واحدة تقريبًا أسفل عظم القص، قم بإجراء شق طولي صغير على طول الجلد، ثم على طول الخط الأبيض (linear alba). ضع الغطاء المعقم مقصوص المسبق فوق منطقة البطن بحيث تتماشى الفتحة مع الشق. اضغط برفق حول الشق للكشف عن الأمعاء الدقيقة. وباستخدام مسحات قطنية، اسحب جزءًا من الأمعاء الدقيقة برفق وضع المساريق (mesentary) على المنصة البلاستيكية التي تحتوي على محلول ملحي معقم، ثم حدد موقع اللفائفي (ileum).

حدد من ست إلى ثمانٍ نوافذ مساريقية وعائية، وهي الأغشية الرقيقة الشفافة الموجودة بين أزواج الشرايين والأوردة التي تغذي الأمعاء الدقيقة. سجل وقت بدء التخدير الخارجي واضبط مؤقتاً لمدة 20 دقيقة. ضع علامة على النافذتين المساريقيتين الموجودتين في المركز باستخدام خيط جراحي معقم قياس 7/0 في المنطقة الدهنية القريبة من الأمعاء.

قم بتعويض المحلول الملحي في طبق بتري بشكل متقطع باستخدام حقنة معقمة سعة 5 mL لضمان بقاء النسيج مغموراً ورطباً. بعد انتهاء فترة الإخراج، أعد المساريق إلى التجويف البطني. أغلق العضلات البطنية باستخدام خيط جراحي أحادي الخيط قياس 5-0 بنمط الغرز المتقطعة.

ثم أغلق الجلد باستخدام خيوط جراحية أحادية الخيط قياس 4-0 بنمط غرز منفصلة، وامسح منطقة الخياطة بمسحات متبادلة باستخدام شاش معقم مبلل بـ 70% isopropyl alcohol واليود للتطهير، ثم ضع جل مزلق على كلتا عيني الجرذ وأعِده إلى القفص للتعافي. وفي اليوم المحدد بعد التحفيز، يتم تخدير الجرذ وقتله رحيمًا وفقًا للإرشادات المؤسسية. بعد ذلك، أعد فتح التجويف البطني وغطِّ المنطقة البطنية بقطعة من الغلاف البلاستيكي. الآن، اسحب الأمعاء الدقيقة برفق وحدد موقع النافذتين الممتلئتين باستخدام الملاقط والمقصات الدقيقة.

قم بقص كل نافذة من نوافذ المساريق الخارجية، بما في ذلك حافة من الدهون. حاول تجنب القطع عبر أزواج الشرايين والأوردة الموجودة ضمن الحافة الدهنية للنوافذ لتقليل احتمالية امتلاء النوافذ بالدم. كما يجب تقليل القطع عبر الأمعاء الذي قد يؤدي إلى خروج محتويات الأمعاء.

عند ملامسة النوافذ، اغمر كل نافذة فوراً في PBS. ثم استخدم الملاقط لفرد الأنسجة على شرائح مجهرية مشحونة إيجابياً، مع تثبيت نسيجين في كل شريحة. وبعد أن تجف الأنسجة جزئياً، أزل الدهون الزائدة باستخدام شفرة مشرط.

قم بتثبيت العينات في الميثانول لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة -20 °C بوضعها في المجمد. جفف الشرائح بالتفريغ الهوائي لإزالة محلول المنظم الزائد. كما يجب تحديد حواف الأنسجة باستخدام قلم شمعي لمنع التدفق غير المنضبط لمحاليل الأجسام المضادة بعيداً عن النسيج.

الآن، قم بتنقيط 200 µL تقريباً من محلول الأجسام المضادة الأولية المخففة لتغطية النسيج بالكامل. يتم التحضين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم تُغسل الأنسجة باستخدام PBS مضاف إليه 0.1% sapin مع ثلاث عمليات استبدال للمحلول المنظم. بعد ذلك، أضف محلول الأجسام المضادة الثانوية strep adin peroxidase وقم بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، وبعد ثلاث غسلات، يتم تحضين العينات في vector nova red لمدة 15 دقيقة.

اشطف بالماء لتثبيت الشرائح. اغمس الشرائح في ethanol 95% لـ 10 مرات، تليها خطوات تجفيف متتالية. اترك الشرائح لتجف ثم غطِّ الأنسجة بطبقة رقيقة من مادة التثبيت، وضع أغطية الشرائح بعد التجفيف بالتفريغ ووضع العلامات.

الشرائح. غطِّ عينات الأنسجة بمحلول الأجسام المضادة الأولية المخفف. حضّن العينات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS مضاف إليه 0.1% saponin لمدة 10 دقائق لكل غسلة. ثم أضف الجسم المضاد الثانوي واحضنه لمدة ساعة واحدة. قم بإجراء عمليات الغسل في PBS مضاف إليه 0.1% Saponin، ثم قم بتثبيت الشرائح في PBS مع glycerol وأغلقها باستخدام طلاء الأظافر.

نوضح هنا كيفية تعديل طبق بتري شائع لاستخدامه كمنصة جراحية. تم استخدام صلصال تشكيل أصفر لتوفير سطح أملس يسمح بسحب المساريق عبر الفتحة المقطوعة مسبقاً. ومرة أخرى، تُعرّف النوافذ المساريقية الموضحة هنا في المنصة خلال فترة الإخراج الخارجي بأنها الأغشية الرقيقة الشفافة الموجودة بين أزواج الشرايين والأوردة التي تغذي الأمعاء هنا.

يحدد وسم PCAM جميع أنواع الأوعية الدموية على طول التسلسل الهرمي لشبكات الأوعية الدموية الدقيقة التي تخضع لإعادة التشكيل في نقاط زمنية محددة بعد الإخراج الخارجي. ويمكن استخدام هذه الصور لقياس مقاييس تكوين الأوعية الدموية في نقاط زمنية محددة بعد التحفيز.

يتيح وسم PCAM التمييز بين الشرايين والأوردة. لاحظ أن الشرايين المغذية عادةً ما تظهر أقطاراً أصغر ومورفولوجيا خلوية بطانية مستطيلة مقارنةً بالأوردة المقترنة. وتشمل الخصائص النموذجية لشبكات إعادة التشكيل المنطقة الوعائية، وتبرعم الشعيرات الدموية، وكثافة الأوعية.

يؤدي التحديد الكمي لهذه المقاييس التوليدية الوعائية المختلفة إلى توصيف المجرى الزمني لنمو الشبكة. حيث تصل عملية تبرعم الشعيرات الدموية من الأوعية الموجودة مسبقاً إلى ذروتها بين اليوم الثالث واليوم الخامس، ثم تعود إلى المستوى غير المحفز بحلول اليوم 10. ويتبع هذه الزيادة العابرة في التبرعم زيادات في المنطقة الوعائية والكثافة الوعائية في مختبرنا.

لقد استُخدم هذا النظام النموذجي لتحديد تغيرات نمطية خلوية جديدة في نقاط زمنية محددة خلال عملية إعادة التشكيل هذه. حيث يقوم وسم Immunofluorescent PCA بصب الخلايا البطانية باللون الأحمر، بينما يقوم وسم class three beta tubulin بصب الأعصاب والطفيليات الموجودة على طول الأوعية الدموية المكونة للأوعية باللون الأخضر. ومن المثير للاهتمام أن تعبير class three beta tubulin يكون خاصاً بالأعصاب في الأنسجة غير المحفزة.

وفي المقابل، يتم التعبير عن بيتا توبولين من الفئة الثالثة بواسطة الخلايا المحيطة بالأوعية خلال ذروة التبرعم الشعيري. وتسلط هذه النتيجة الضوء على فائدة استخدام هذا النموذج الوعائي البسيط والقوي لتحديد أنواع جديدة من الخلايا المشاركة في عملية تكوين الأوعية الدموية. وبحلول اليوم 10، يبدأ نمط التعبير عن بيتا توبولين من الفئة الثالثة في العودة إلى الحالة غير المحفزة.

يمكن استخدام هذا النموذج أيضًا في دراسات السلالات الخلوية. وتدعم هذه الدراسات الأولية إمكانية دمج الخلايا في أنسجة المساريق التي تخضع لإعادة التشكيل، حيث تم دمج خلايا نخاع العظم الموسومة مسبقًا أو الخلايا الجذعية الميزنكيمية فوق نوافذ المساريق خلال فترة التعرض الخارجي التي استمرت 20 دقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نموذج استدخال مساريق الجرذ الخاص بنا لاستقصاء الديناميكيات الخلوية المشاركة في نمو الشبكة الوعائية الدقيقة.

يمكن تنفيذ هذه التقنية البسيطة في غضون 45 دقيقة إلى ساعة تقريبًا. وتذكر أنه من الضروري التعامل بدقة مع المساريق وتجنب ثقب أي أوعية دموية بعد الإجراء الجراحي. كما يمكن إجراء الوسم المناعي لتحديد أنواع متعددة من الخلايا على طول الأوعية الدموية.

يمكنك أيضاً وضع علامات للأوعية اللمفاوية والأعصاب. وهذا يتيح لنا استقصاء التغيرات المظهرية الخلوية المشاركة في تكوين الأوعية الدموية فحسب، بل والتنسيق بين تكوين الأوعية الدموية، وتكوين الأعصاب، وتكوين الأوعية اللمفاوية.