جرذ الاهتمام لأمور ظاهرية مساريق: نموذج للتحقيق في حيوية الخلوي شارك في الأوعية الدموية

تهدف التجربة التالية إلى تحديد الديناميكيات الخلوية المكانية والزمانية المشاركة في عملية تكوين الأوعية الدموية، والتي تُعرف بأنها نمو أوعية دموية جديدة من أوعية موجودة مسبقاً. باستخدام نموذج بسيط وقابل للتكرار، يتم أولاً تحفيز تكوين الأوعية الدموية عن طريق إخراج مساريق الجرذ لفترة وجيزة، ثم جمع أنسجة المساريق في نقاط زمنية مختلفة بعد التحفيز. بعد ذلك، يتم إجراء الوسم المناعي لمقاطع الأنسجة.

على سبيل المثال، استخدم مؤشراً للخلايا البطانية لتصوير كامل الأوعية الدموية التي تخضع لإعادة التشكيل داخل النسيج، وإنشاء تصور ثنائي الأبعاد أساسي لشبكات الأوعية الدقيقة النامية. ويعد هذا النموذج جذاباً لأنه يحدث زيادة ملحوظة في مقاييس تكوين الأوعية الدموية المتعددة خلال فترة زمنية قصيرة نسبياً عند أخذها مجتمعة. وقد ثبت أن تصوير الشبكات على مستوى الخلية الواحدة وربط هذه المقاييس بالوسم متعدد الخلايا مفيد للغاية في تحديد الأنماط الظاهرية الخلوية الجديدة التي تشمل تبرعم الشعيرات الدموية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية تتعلق بالديناميكيات الخلوية المشاركة في نمو الشبكة الوعائية الدقيقة. وتشمل هذه الأسئلة تحديد توقيت ومكان تواجد خلايا معينة خلال عملية تبرعم الشعيرات الدموية. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه الطريقة في بساطتها، وتطلبها حداً أدنى من التدخل الجراحي، وقدرتها على إحداث استجابة وعائية قوية خلال فترة زمنية قصيرة نسبياً.

بالإضافة إلى ذلك، تستفيد هذه الطريقة من مساريقا RAP، وهي نسيج يسمح بمراقبة شبكة سليمة وصولاً إلى مستوى الخلية الواحدة. وبناءً على خبرتنا، فإن تعلم هذه التقنية سهل للغاية وبالتالي يمكن تكرارها من قبل باحث لآخر عند استعراض الإجراء. وسيقوم اليوم بيتر ستابلر، وهو طالب دراسات عليا في مختبرنا، بالتحضير للجراحة كما هو مفصل في النص المصاحب.

بعد حلاقة منطقة البطن للجرذ، ضع الجرذ المخدر على ظهره فوق وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم، ثم نظف منطقة البطن بمسحات متبادلة من شاش معقم (GREs) مغموس في كحول الإيزوبروبيل بتركيز 70% واليود. على بعد بوصة واحدة تقريباً أسفل عظم القص، قم بإجراء شق طولي صغير على طول الجلد، ومن ثم في الخط الأبيض (linear alba). ضع الغطاء المعقم المقطع مسبقاً فوق منطقة البطن بحيث تتماشى الفتحة مع الشق. اضغط برفق حول الشق لإظهار الأمعاء الدقيقة. وباستخدام مسحات قطنية، اسحب برفق جزءاً من الأمعاء الدقيقة مع وضع المساريقا (mesentary) على المنصة البلاستيكية التي تحتوي على محلول ملحي معقم، ثم حدد موقع اللفائفي (ileum).

حدد ست إلى ثمانٍ من النوافذ المساريقية الموعاة، وهي الغشاء الرقيق الشفاف الموجود بين أزواج الشرايين والأوردة التي تغذي الأمعاء الدقيقة. سجل وقت بدء التعريض الخارجي واضبط مؤقتًا لمدة 20 دقيقة. ميز النافذتين المساريقيتين الموجودتين في المركز باستخدام خيط جراحي معقم مقاس 7/0 في المنطقة الدهنية القريبة من الأمعاء.

قم بتعويض المحلول الملحي في طبق بتري بشكل متقطع باستخدام حقنة معقمة سعة 5 mL لضمان بقاء النسيج مغموراً ورطباً. بعد انتهاء فترة الإخراج الخارجي، أعد المساريق إلى التجويف البطني. أغلق العضلة البطنية باستخدام خيوط جراحية أحادية الشعيرة قياس 5-0 بنمط الغرز المتقطعة.

ثم أغلق الجلد باستخدام خيوط جراحة أحادية الشعيرة قياس 4-0 بنمط غرز متقطعة، وامسح منطقة الخياطة بمسحات متبادلة باستخدام شاش معقم مبلل بكحول الإيزوبروبيل 70% واليود للتطهير، وضع جل تزييت على كلتا عيني الجرذ ثم أعيده إلى قفصه للتعافي. وفي اليوم المحدد، بعد التحفيز، قم بتخدير الجرذ وقتله رحيمًا وفقًا للإرشادات المؤسسية. ثم أعد فتح التجويف البطني وغطِ المنطقة البطنية بقطعة من الغلاف البلاستيكي. والآن اسحب الأمعاء الدقيقة برفق وحدد النافذتين الممتلئتين باستخدام الملقط ومقصات دقيقة.

قُم بقص كل نافذة من النوافذ المساريقية المُخرجة، مع تضمين حافة من الدهون. حاول تجنب القطع عبر أزواج الشرايين والأوردة الموجودة ضمن الحافة الدهنية للنوافذ لتقليل احتمالية امتلاء النوافذ بالدم. كما يجب تقليل القطع عبر الأمعاء الذي قد يؤدي إلى خروج المحتويات المعوية.

عند ملامسة النوافذ، اغمر كل نافذة فوراً في PBS. ثم استخدم الملقط لفرد الأنسجة على شرائح مجهرية موجبة الشحنة، مع تثبيت نسيجين في كل شريحة. بعد أن تجف الأنسجة جزئياً، قم بإزالة الدهون الزائدة باستخدام شفرة مشرط.

ثبّت العينات في الميثانول لمدة 30 دقيقة عند -20 درجة Celsius عن طريق وضعها في المجمد. جفف الشرائح بالتفريغ الهوائي لإزالة محلول المنظم الزائد. كما يجب تحديد حدود الأنسجة باستخدام قلم شمعي لمنع التدفق غير المنضبط لمحاليل الأجسام المضادة بعيداً عن النسيج.

الآن، قم بتنقيط 200 µL تقريبًا من محلول الأجسام المضادة الأولية المخففة لتغطية النسيج بالكامل. يتم التحضين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم تُغسل الأنسجة باستخدام PBS مضاف إليه 0.1% sapin من خلال ثلاث عمليات تبديل للمحلول المنظم. بعد ذلك، أضف محلول الأجسام المضادة الثانوية strep adin peroxidase وحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، وبعد ثلاث عمليات غسيل، يتم تحضين العينات في vector nova red لمدة 15 دقيقة.

اشطف بالماء لتثبيت الشرائح. اغمس الشرائح في ethanol 95% لـ 10 مرات، تليها خطوات تجفيف متتالية. اترك الشرائح لتجف ثم غطِّ الأنسجة بطبقة رقيقة من مادة التثبيت، وضع أغطية الشرائح بعد التجفيف بالتفريغ ووضع العلامات.

الشرائح. غطِّ عينات الأنسجة بمحلول الجسم المضاد الأولي المخفف. احضنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS مضاف إليه saponin بنسبة 0.1% لمدة 10 دقائق لكل غسلة. بعد ذلك، أضف الجسم المضاد الثانوي واحضن العينة لمدة ساعة واحدة. قم بإجراء عمليات الغسل في PBS مضاف إليه Saponin بنسبة 0.1%، ثم قم بتثبيت الشرائح في PBS مع الجلسرول وأحكم إغلاقها بطلاء الأظافر.

نوضح هنا بالتفصيل كيفية تعديل طبق بتري شائع لاستخدامه كمنصة جراحية. وقد استُخدم صلصال النمذجة الأصفر لتوفير سطح أملس لسحب المساريق من خلال الثقب المقطع مسبقاً. ومجدداً، تُعرَّف النوافذ المساريقية الموضحة هنا في المنصة خلال فترة الإخراج الخارجي بأنها الأغشية الرقيقة الشفافة الموجودة بين أزواج الشرايين والأوردة التي تغذي الأمعاء هنا.

يحدد وسم PCAM جميع أنواع الأوعية الدموية على طول التسلسل الهرمي لشبكات الأوعية الدقيقة التي تخضع لإعادة التشكيل في نقاط زمنية محددة بعد عملية الإخراج الخارجي. ويمكن استخدام هذه الصور لقياس معايير تكوين الأوعية الدموية في نقاط زمنية محددة بعد التحفيز.

يسمح وسم PCAM بالتمييز بين الشرايين والأوردة. يُلاحظ أن الشرايين المغذية تظهر عادةً بأقطار أصغر ومورفولوجيا خلايا بطانية مستطيلة مقارنة بالأوردة المقابلة. وتشمل الخصائص النموذجية لشبكات إعادة التشكيل المنطقة الوعائية، والتبرعم الشعيري، وكثافة الأوعية.

يحدد التحديد الكمي لهذه المقاييس المختلفة لتكوين الأوعية الدموية المسار الزمني لنمو الشبكة. وتصل عملية التبرعم الشعيري من الأوعية الموجودة مسبقاً إلى ذروتها بين اليوم الثالث واليوم الخامس، ثم تعود إلى المستوى غير المحفز بحلول اليوم 10. ويلي هذه الزيادة العابرة في التبرعم زيادة في المنطقة الموعاة والكثافة الوعائية في مختبرنا.

لقد استُخدم نظام النموذج هذا لتحديد تغيرات نمطية خلوية جديدة في نقاط زمنية محددة خلال عملية إعادة التشكيل هذه. وتصبغ وسمات PCA المناعية الفلورية الخلايا البطانية باللون الأحمر، بينما تصبغ وسمات tubulin beta class three الأعصاب والطفيليات الموجودة على طول الأوعية الدموية المكونة للأوعية باللون الأخضر. ومن المثير للاهتمام أنه في الأنسجة غير المحفزة، يكون تعبير tubulin beta class three خاصاً بالأعصاب.

وفي المقابل، يتم التعبير عن بيتا توبولين من الفئة الثالثة بواسطة الخلايا المحيطة بالأوعية خلال ذروة التبرعم الشعيري. وتبرز هذه النتيجة أهمية استخدام هذا النموذج الوعائي البسيط والقوي لتحديد أنواع جديدة من الخلايا المشاركة في عملية تكوين الأوعية الدموية. وبحلول اليوم العاشر، يبدأ نمط التعبير عن بيتا توبولين من الفئة الثالثة في العودة إلى الحالة غير المحفزة.

يمكن استخدام هذا النموذج أيضاً في دراسات السلالات الخلوية. وتدعم هذه الدراسات الأولية إمكانية دمج الخلايا في أنسجة المساريق التي تخضع لإعادة التشكيل، حيث تم دفق خلايا نخاع العظم الموُسمة مسبقاً أو الخلايا الجذعية الميزنشيمية فوق نوافذ مساريقية خلال فترة التعرض الخارجية التي استمرت 20 دقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية استخدام نموذج استبطان المساريق في الجرذان الخاص بنا لبحث الديناميكيات الخلوية المشاركة في نمو الشبكة الوعائية الدقيقة.

يمكن تنفيذ هذه التقنية البسيطة في غضون 45 دقيقة إلى ساعة واحدة تقريبًا. تذكر أنه من الضروري التعامل برفق مع المساريق وتجنب ثقب أي أوعية دموية بعد الإجراء الجراحي. كما يمكن إجراء الوسم المناعي لتحديد أنواع متعددة من الخلايا على طول الأوعية الدموية.

يمكنك أيضاً وضع علامات لتمييز الأوعية اللمفاوية والأعصاب. يتيح لنا ذلك استقصاء التغيرات المظهرية الخلوية المشاركة في عملية تكوين الأوعية الدموية، بالإضافة إلى التنسيق بين تكوين الأوعية الدموية، وتكوين الأعصاب، وتكوين الأوعية اللمفاوية.