الإذابة والحيوية، من اقتران نقاط الكم وفحوصات السمية البكتيرية التي منحنى النمو والكونت بلايت

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء فحص عالي الإنتاجية للتأثيرات المضادة للبكتيريا للجسيمات النانوية سواء كانت مقترنة بالمضادات الحيوية أو بدونها. وفي هذه التجربة، يتم اختبار التأثيرات المضادة للبكتيريا لنقاط كادميوم تيلورايد الكمومية المقترنة بـ poly mix و B لتحقيق هذا الهدف. يتم أولاً إذابة النقاط الكمومية في me, capto proprionic acid.

بعد ذلك، يتم ربط النقاط الكمومية بـ poly mix و B، ثم تُعالج البكتيريا التي تم زرعها مع المضادات الحيوية بكل من النقاط الكمومية المقترنة بالمضاد الحيوي وغير المقترنة، ويُعرض نصف العينات للإشعاع بضوء أزرق بطول موجي 440 nanometer لمدة 30 دقيقة، مما يؤدي إلى توليد الإكسيتون وأنواع الأكسجين التفاعلية من قبل النقاط الكمومية لتقييم تأثير علاجات النقاط الكمومية على نمو البكتيريا وبقائها. يتم أخذ قراءات الكثافة الضوئية وإجراء تعداد المستعمرات. وتشير البيانات الناتجة إلى أن تطبيق النقاط الكمومية من تيلوريد الكادميوم المقترنة بالمضادات الحيوية، متبوعاً بالإشعاع، يحقق أكبر تأثيرات إبادة بين الظروف المختبرة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول تأثير النقاط الكمومية من تيلوريد الكادميوم واقترانها بـ polyx in على نمو بكتيريا E coli، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنواع أخرى من الجسيمات النانوية والمضادات الحيوية على سلالات بكتيرية مختلفة. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن أي زيادة في MPA ستؤدي إلى تكتل النقاط الكمومية، وإذا قاموا بسحب كمية ولو صغيرة من toline، فسوف يتسبب ذلك في إتلاف المرشح.

على الرغم من أننا سنقوم اليوم بشرح طريقة لتقييم التأثيرات المضادة للبكتيريا للنقاط الكمومية من يوديد الكادميوم (KE IDE) المقترنة بالمضادات الحيوية، إلا أنه يمكن استخدام طريقة مماثلة مع أنواع أخرى من النقاط الكمومية مثل فوسفات الإنديوم، وكبريتات الزنك، وكبريتات الزنك بيوديد الكادميوم. ابدأ هذا الإجراء بتحضير محلول من النقاط الكمومية من تيلوريد الكادميوم أو CDTE في التولوين بتركيز 15 micromolar في قارورة زجاجية، ثم قم بقياس الكثافة الضوئية أو OD عن طريق مطيافية الامتصاص، وباستخدام ماصة، انقل 200 microliters من هذا المحلول المخزون إلى قارورة زجاجية.

تجنب استخدام البلاستيك. بعد ذلك، أضف 800 µL من التولوين، و 1 mL من محلول البورات المنظم بتركيز 200 mM، و 2 µL من حمض الميركابتوبروبيونيك بتركيز 11.5 M أو MPA، ثم أغلق القارورة بإحكام ورجها بقوة لمدة تتراوح من 30 إلى 60 ثانية. بعد الرج، ستنفصل الطوران المائي والعضوي تلقائياً.

سوف تكتسب المرحلة المائية لون النقاط الكمومية. ولتجنب طبقة التبليط، قم بإزالتها، ثم قم بإزالة مرحلة النقاط الكمومية ونقلها إلى قنينة نظيفة. ولتنقية النقاط الكمومية المُذابة، انقلها إلى مرشح طرد مركزي بسعة 500 µL.

أضف 100 µL من محلول منظم bore eight بتركيز 50 mM ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 3000 ×g لمدة 13 دقيقة. كرر عملية الغسل هذه أربع مرات، وبعد الغسلة النهائية، قم بتعليق النقاط الكمومية المغسولة في 500 µL من محلول منظم bore، واحفظها عند درجة حرارة 4 °C.

ستظل مستقرة لمدة تتراوح من أسبوع إلى أسبوعين. لتقدير تركيز النقاط الكمومية، قم بقياس أطياف الامتصاص والانبعاث. يوضح هذا الشكل نقاط CDTE الكمومية تحت إضاءة مصباح UV وأطياف الانبعاث قبل وبعد الإذابة في الماء، مما يظهر تغيراً طفيفاً في الخصائص البصرية نتيجة تبادل الليجاند.

ينطبق هذا الجزء من البروتوكول على أي جسيمات نانوية مائية مشحونة سلبياً، بما في ذلك الطحالب، والنقاط الكمومية التجارية، والجسيمات المعدنية، وغيرها. في هذا المثال، سيتم ربط المضاد الحيوي poly mixen B أو PMB بالنقاط الكمومية بنسبة مولية تبلغ 30 إلى 1. يتميز PMB بشحنته الموجبة ويتجمع ذاتياً دون الحاجة إلى عملية الربط. الكواشف: إذابة PMB في الماء.

بتركيز 60 micromolar. بالنسبة لصفيحة ذات 96 بئراً تحتوي على 0.3 milliliters من البكتيريا لكل بئر في مكررات رباعية، فإن 0.5 milliliters من المتقارن بتركيز 200 nano molar تكون كافية لتحضير ذلك بإضافة 100 microliters من النقاط الكمومية بتركيز one micromolar في محلول bore buffer بتركيز 50 millimolar إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.

بعد ذلك، أضف 50 µL من محلول المضاد الحيوي PMB بتركيز 10 x أو 60 µM في الماء إلى أنبوب المتقارن (conjugate tube). أضف 50 µL من الماء إلى أنبوب التحكم. أكمل الحجم إلى 0.5 mL باستخدام محلول منظم ate بتركيز 50 mM. قم بتغطية الأنابيب بورق ألومنيوم لحمايتها من الضوء وضعها على جهاز تدوير لمدة ساعة واحدة.

في حال حدوث تجمع، كرر عملية الاقتران باستخدام تركيزات أقل من المضاد الحيوي. قم بمعايرة التركيز تصاعدياً حتى تتوقف الجسيمات عن التجمع لغسل المقترنات. صب المحاليل عبر مرشح بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 10,000، وهو مرشح فعال لمعظم المضادات الحيوية ولكن ليس للبروتينات أو الأجسام المضادة.

أخيرًا، قم بتقدير عدد جزيئات المضاد الحيوي لكل نقطة كمومية عن طريق قياس الامتصاص أو مطيافية الفلورة أو الفصل الكهربائي للهلام أو باستخدام مطيافية الأشعة تحت الحمراء بتحويل فورييه. يوضح هذا الشكل أطياف الامتصاص والانبعاث النموذجية للنقاط الكمومية قبل اقتران PMB، وطيف الانبعاث بعد إضافة 160 مكافئ مولار من PMB.

تظهر هنا العلاقة بين نسبة PMB وكثافة انبعاث النقاط الكمومية (التي تشير إليها المربعات) وموقع الطول الموجي للذروة (الذي تشير إليه المثلثات). ومع زيادة تركيز PMB، تنخفض كثافة انبعاث QD، مما يؤدي إلى إزاحة في الطول الموجي لذروة الانبعاث. يتم تنفيذ الجزء التالي من البروتوكول لتحديد التركيز المثبط لنصف الحد الأقصى أو IC 50 للمضاد الحيوي وسمية النقاط الكمومية في المساء قبل يومين من تجربة الاقتران.

قم بتلقيح 10 milliliters من وسط LB باستخدام مستعمرة حديثة من بكتيريا e coli. وفي اليوم التالي، وقبل بدء التجربة بساعة أو ساعتين، املأ كل بئر من آبار لوحة 96 بئر شفافة. يجب ترتيب لوحة المقايسة باستخدام وسط النمو كما هو موضح هنا.

يجب توزيع العينات في أطباق مكررة ثلاث مرات، كما يجب أن تغطي تركيزات المضادات الحيوية نطاقاً واسعاً بما يكفي ليشمل تركيزاً واحداً يثبط البكتيريا بشكل طفيف وتركيزاً آخر يقتلها جميعاً. كما يجب تضمين جميع الآبار التي تحتوي على النقاط الكمومية بالتركيزات المقرر استخدامها في تجارب الاقتران بشكل مكرر ثلاث مرات أيضاً. وباستخدام ماصة متعددة القنوات، يتم ملء الآبار المناسبة بـ 1 إلى 50 µL من المزرعة البكتيرية.

سيعتمد التركيز على سرعة نمو السلالة المحددة وسيتطلب معايرة وفقاً لذلك. ولمراقبة النمو، ضع الطبق في قارئ الأطباق واضبطه على القراءة كل 10 دقائق لمدة ساعتين عند 600 nanometers. وعندما تصل جميع الخلايا إلى OD تتراوح بين 0.1 و 0.15، أخرج الطبق من قارئ الأطباق وأوقف التسجيل.

بعد ذلك، أضف PMB الموجود في النقاط الكمومية إلى الآبار المناسبة، وقم بتغطية نصف الطبقة بورق الألمنيوم في ثلاث مكررات. ثم ضع الطبقة تحت مصباح 440 nanometer مخصص مصنوع من صمامات LED بقدرة 2.4 milliwatt لمدة 30 دقيقة لتعريض الجانب المضاء من الطبقة. وبعد التعرض للضوء، ضع الطبقة في قارئ الطبقات وسجل OD 600 كل 10 دقائق لمدة تتراوح من 5 إلى 12 ساعة اعتماداً على معدل النمو. حافظ على درجة الحرارة أقل من 32 degrees Celsius قدر الإمكان لتجنب جفاف المزارع باستخدام البرنامج.

قم برسم منحنيات النمو عند نقطة زمنية مختارة مقابل لوغاريتم التركيز، ثم حدد قيمة IC 50 للمضاد الحيوي باستخدام معادلة هيل الموضحة على الشاشة، حيث تمثل H معامل هيل. تمثل Y max أعلى نقطة للنمو، بينما تمثل Y min نقطة الصفر والتي يفضل أن تكون أيضاً عند مرحلة الثبات. وفي نهاية فترة التسجيل، ستشير الآبار الرائقة إلى موت الخلايا تماماً، ويجب أن يظهر تدرج في كثافة الخلايا مع زيادة تركيزات الدواء.

يجب أن تظهر البكتيريا منحنيات نمو على شكل حرف S كما هو موضح هنا. ويختلف موقع الهضبة القصوى بشكل كبير من سلالة إلى أخرى كما يعتمد أيضاً على درجة الحرارة. يمكن اختيار نقطة زمنية معينة لتكون ممثلة، ثم يتم رسم القيم مقابل لوغاريتم المضاد الحيوي لاستخراج قيمة IC 50 لتقييم النقاط الكمومية.

يمكن أيضاً رسم مخطط للبقاء على قيد الحياة مقابل لوغاريتم تركيز النقاط الكمومية، ولكن من النادر تحقيق قتل بكتيري ملحوظ باستخدام النقاط الكمومية وحدها بالتركيز المستخدم. وبمجرد تحديد سمية النقاط الكمومية والمضادات الحيوية بمفردها، يمكن تطبيق البروتوكول نفسه لتحديد سمية المضاد الحيوي. النقاط الكمومية المقترنة موضحة.

فيما يلي نموذج لتخطيط المقايسة. لاحظ أن المترافقات تُختبر بتراكيز متزايدة في أربعة مكررات؛ كما يجب تضمين شريط تحكم يحتوي على البكتيريا فقط، وشريط يحتوي على الدواء فقط، وآبار عينات للنقاط الكمومية فقط. يمكن بعد ذلك استخدام قراءات OD 600 لإنشاء منحنيات النمو، وقيم IC50 كما سبق.

يوضح هذا الشكل مثالاً لمركبات مقترنة تمتلك سمية مماثلة للمضاد الحيوي وحده، ومثالاً لمركبات مقترنة أكثر سمية. ولتحديد عدد الوحدات المكونة للمستعمرات أو CFU لكل حالة، اختر بئراً واحدة أو أكثر من طبق الـ 96 بئراً المعالج لاستخدامها في إجراء عد الأطباق. ثم قم بإجراء تخفيف تسلسلي لكل عينة من العينات البكتيرية المختارة باستخدام محلول ملحي.

للقيام بذلك، يتم سحب 180 µL من المحلول الملحي بواسطة الماصة ونقله إلى الأعمدة المناسبة. ثم يتم نقل 20 µL من المحلول البكتيري وتخفيفه بـ 180 µL من المحلول الملحي. يتم تغيير رأس الماصة، ثم الخلط ونقل 20 µL من المحلول البكتيري المخفف إلى 180 µL من المحلول الملحي.

كرر هذه العملية ست مرات. بعد ذلك، خذ 10 µL من كل من التخفيفات الست الأخيرة وقم بنقطها على لوحة مثقاب مستطيلة. يمكن وضع 36 نقطة على اللوحة المستطيلة.

اترك الطبق ليجف لمدة 15 دقيقة على طاولة المختبر، وبعد 15 دقيقة، قم بتحضين الطبق عند 37 °C لمدة 16 ساعة. بعد التحضين، قم بعد المستعمرات لتحديد عدد الوحدات المكونة للمستعمرات لكل مليلتر. اضرب عدد المستعمرات في عامل التخفيف واقسم الناتج على الحجم الذي تم زرعه في الطبق لتحديد تأثير المعاملات على النمو البكتيري.

تم قياس كثافة خلايا e coli عند OD 600. تظهر هنا منحنيات نمو بكتيرية تمثيلية مع تركيزات مختلفة من الدواء، تتراوح من الصفر وصولاً إلى الموت الخلوي الكامل. تشير الرموز المفتوحة إلى PMB فقط مع توضيح التركيزات المذكورة.

تمثل الرموز المصمتة C-D-T-E-P-M-B بدون تشعيع، بينما تمثل الرموز نصف الممتلئة C-D-T-E-P-M-B مع التشعيع. لم يكن للتشعيع أي تأثير على عينات PMB فقط، لذا تم حذف هذه المنحنيات من أجل وضوح العرض. فيما يلي مخططات لقيم منحنى النمو عند 200 دقيقة مقابل log PMB والملاءمات لهذه المعادلة لتحديد قيم IC 50 للتحكم في تأثيرات الضوء.

تم رسم منحنى باستخدام المضاد الحيوي فقط مع التعريض للضوء لمدة 30 دقيقة. يوضح هذا الشكل بقاء البكتيريا على قيد الحياة عند 200 دقيقة مقابل تركيز QD باستخدام CDTE qds. لوحظت بعض السمية عند التعريض للضوء، ولكنها كانت قليلة جداً لدرجة لا تسمح بتحديد قيمة IC 50.

يشير هذا إلى أن سمية CDTE بمفرده عند التركيزات المستخدمة في تجربة الاقتران ضئيلة للغاية بحيث تسمح بمقارنة تأثيرات العلاجات المختلفة على نمو الخلايا؛ حيث تم رسم قيم منحنى النمو عند 200 دقيقة ومطابقتها مع المعادلة الموضحة سابقاً كما يظهر هنا. كانت مرافقات C-D-T-E-P-M-B أكثر سمية من PMB بمفرده. وفي المقابل، لم تظهر مرافقات الجسيمات النانوية الذهبية A-U-P-M-B أي زيادة في السمية مقارنة بـ PMB بمفرده لتحديد تأثير العلاجات على بقاء البكتيريا.

تم تحديد عدد الوحدات المكونة للمستعمرات لبكتيريا e coli المودعة في طبق يحتوي على 96 بئراً والمعالجة بـ P-M-B-Q-D-P-M-B أو QD بمفردها، مع أو بدون التعرض لإشعاع I لمدة 30 دقيقة، ثم حضنت عند 32 °C لمدة أربع ساعات. تم إجراء تخفيفات متسلسلة لكل عينة بكتيرية باستخدام محلول ملحي، وتم زرع 10 µL من المحاليل ذات التراكيز من 100x إلى 10⁷x على أطباق آغار. حضنت الأطباق عند 37 °C وتم عد المستعمرات بعد 16 ساعة.

في هذا المثال، تمثل أعمدة الطبق من A إلى C بكتيريا عولجت بتراكيز متزايدة من CDTE. أما الأعمدة من D إلى F فتمثل بكتيريا عولجت بتراكيز متزايدة من المترافقات، بينما تمثل العينات بدون إشعاع المجموعة الضابطة. وتظهر التخفيفات على طول الصفوف، بالتزامن مع التعرض للإشعاع لمدة 30 دقيقة.

تشير البيانات إلى أنه عند التعريض للإشعاع، تظهر المترافقات تثبيطاً أكبر للنمو البكتيري مقارنة بالمترافقات غير المعرضة للإشعاع. تذكر أن كواشف ca شديدة السمية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء القفازات، ومعاطف المختبر، والنظارات الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الفحص عالي الإنتاجية للتأثير المضاد للبكتيريا للجسيمات النانوية، سواء كانت مترافقة مع مضادات حيوية أو بدونها.