في Electroporation المختبر من شفة السفلى المعينية من أجنة الفئران Midgestation

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحكم في التعبير الجيني في الخلايا السلفية للدماغ الخلفي الجنيني من خلال إدخال الحمض النووي البلازميدي عن طريق التثقيب الكهربائي في نقاط زمنية مبكرة من فترة الحمل. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الأجنة في اليوم 11.5 من الحمل وتوجيهها بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى في محلول ملحي منظم بالفوسفات معقم. والخطوة الثانية هي حقن حوالي 50 µL من بلازميد التعبير في 0.01% fast green.

في حالة الحقن الناجح، سيمتلئ الجهاز البطيني بالكامل بخليط DNA fast green. بعد ذلك، يتم تعريض الجنين لنبضة كهربائية. وسيقوم جانب الجنين الأقرب إلى القطب الموجب بامتصاص الـ plasmid DNA.

سيعمل الجانب الآخر كضابط سلبي داخلي. وتتمثل الخطوة النهائية في وضع الأجنة في مستنبت نسيجي لمدة 24 ساعة على الأقل. وفي النهاية، سيتم التعبير عن الجين الذي تم إدخاله كهربائيًا بعد 24 ساعة من الاستنبات، ويمكن تقييم ذلك عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية.

تتمثل ميزة هذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في إمكانية التعامل مع أسلاف الدماغ الخلفي الجنينية في نقاط زمنية مبكرة من فترة الحمل. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في هذا المجال، مثل كيفية تأثير الجينات العصبية المختلفة على مصير الأسلاف الجنينية. ابدأ هذا الإجراء بتعقيم أدوات التشريح وغطاء التدفق الصفائحي وفقاً للمخطوطة المرفقة.

لحصد الأجنة، ضع أنثى فأر تم قتلها رحيمًا وهي حامل في اليوم الجنيني E 11.5 على صينية التشريح داخل غطاء التدفق الصفحي. بعد ذلك، رش بطن الفأر بـ 70% ethanol. افتح التجويف البريتوني وثبّت الجدران بالدبابيس على صينية التشريح.

ثم اسحب قرني الرحم بحيث يستقران داخل التجويف الصفاقي. وباستخدام الملقط، افتح جدار قرن الرحم بعناية. استخدم ملعقة بمقاس 20 millimeter لإزالة الأجنة الموجودة في الكيس المحي من المشيمة برفق.

بعد ذلك، ضع الأجنة في طبق زراعة أنسجة مقاس 100 مليمتر، مملوء مسبقاً بـ 10 مليلتر من PBS بتركيز 1x معقم ومسخن مسبقاً. في هذه الخطوة، انقل الجنين الأول إلى طبق جديد مقاس 100 مليمتر مملوء مسبقاً بـ 10 مليلتر من PBS بتركيز 1x معقم ومسخن مسبقاً إلى 37 درجة مئوية.

بعد ذلك، قم بإزالة كيس المح وكيس المح بعناية والتخلص منه. ثم ضع الجنين بحيث يكون الجانب الظهري متجهًا للأعلى. ثبت الجنين برفق باستخدام أقطاب كهربائية measuring 7 mm تحت مجهر تشريحي.

ضع الأقطاب الكهربائية بحيث يكون كل قطب على أحد جانبي الأنبوب العصبي عند مستوى البطين الرابع في الدماغ الخلفي. بعد ذلك، استخدم حقنة سعة 1 cc لسحب خليط من الـ plasmid DNA و 0.01%Fast screen؛ وبشكل عام، يجب أن تكون 500 microliters من الخليط كافية لإجراء عملية التثقيب الكهربائي لـ 8 إلى 10 أجنة على الأقل. بعد ذلك، قم بثقب الصفيحة السقفية التي تعلو البطين الرابع برفق باستخدام إبرة توبيكولين مقاس 25 gauge وبطول five eighth متصلة بالحقنة سعة 1 CC.

ثم يتم حقن حوالي 50 µL من خليط DNA DI في البطين. وتتميز عمليات الحقن الناجحة بملء خليط DNA DI للنظام البطيني بأكمله. وتتمثل وسيلة بديلة لإيصال خليط DNA DI في الوصول إلى النظام البطيني عن طريق ثقب الغشاء الشفاف الذي يغطي الدماغ المتوسط، ثم تشغيل مولد النبضات، وبعد ذلك يتم إيصال خمس نبضات مربعة باستخدام مولد نبضات كهربائي ومجاديف قطب كهربائي بحجم 7 mm في الأنسجة الأقرب إلى القطب الموجب الشحنة.

بينما يتم تحضير البلازميد في غطاء تدفق صفائحي، املأ آبار طبق زراعة مكون من 12 بئراً بـ 2 mL من وسط DME MF 12 المدعم بـ 10% fetal bovine serum، و5% equine serum، و1% glutamine، و1% penicillin streptomycin، والذي تم تسخينه مسبقاً إلى 37 °C. بعد ذلك، أمسك الجنين من المنتصف باستخدام ملقط. قم بإزالة الجزء الخلفي من الجنين، ثم ضع الجزء الأمامي في أحد الآبار الممتلئة في طبق الزراعة.

كرر الإجراء لجميع الأجنة واملأ الآبار الخارجية فقط من الطبق ذي الـ 12 بئراً. ولتجنب تلوث المزارع، يتم استزراع الأجنة في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C مع 5% carbon dioxide لمدة 24 ساعة للتعبير عن البلازميد الذي تم إدخاله عبر التثقيب الكهربائي. وفي حال الرغبة في فترة استزراع أطول، املأ الآبار في طبق 12 بئراً جديد بمقدار 2 mL من وسط D-M-E-M-F 12.

انقل الأجنة باستخدام ملعقة معقمة إلى آبار طبق جديد. ثم أعدها إلى الحاضنة عند درجة حرارة 37 °C واستزرعها لمدة تصل إلى 48 ساعة لتثبيت الأجنة من أجل التحليل. املأ طبقاً ذا 12 بئراً بمحلول PBS بتركيز 1×، ثم انقل الأجنة واغسلها عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، يتم تثبيت الأجنة في 2% paraldehyde في محلول PBS بتركيز 1x لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 °C. ثم تُشطف ثلاث مرات في محلول PBS بتركيز 1x عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق. ومرة أخرى، بعد ملء طبق جديد يحتوي على 12 بئراً بـ 30% sucrose في محلول PBS بتركيز 1x.

انقل الأجنة إلى تلك الآبار واتركها لتتوازن طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، قم بتضمين الأجنة في مركب درجة حرارة القطع المثالية (OCT) باستخدام حمام من الإيثانول والثلج الجاف، أو قم بتخزينها عند درجة حرارة -20 °C. في النهاية، قم بتقطيع الأجنة إلى شرائح بسمك 30 micron باستخدام المقطاع بالتجميد (cryostat).

ثبّتها على شرائح زجاجية واحفظها عند درجة حرارة -20 °C باستخدام uni Histochemical. تُظهر الدراسة اللاحقة المعروضة هنا النتائج التمثيلية لكيمياء الأنسجة المناعية لـ GFP في المقاطع المستعرضة لجنين E 11.5 تم إجراء التثقيب الكهربائي له بعد 24 ساعة من الزرع. تشير الأسهم الموضحة هنا إلى الصفيحة السقفية التي تحجز الأجسام المضادة الثانوية.

تظهر النتائج أن المنطقة التي خضعت للتثقيب الكهربائي في الشفة السفلية لـ ROIC كانت محدودة ولم تمتد إلى كامل المحور الأمامي الخلفي للأنبوب العصبي. وهنا تظهر النتائج لبروتينين من البروتينات التي تم تحليلها وهما MASH one و math one. وقد لاحظنا أن غالبية الأجنة احتفظت بمستويات تعبير طبيعية بعد التثقيب الكهربائي والاستزراع مقارنة بالأجنة الضابطة عند المرحلة 11.5. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون ساعة إلى ساعتين إذا نُفذت بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية استخدام مقايسة التثقيب الكهربائي في المختبر (in vitro electroporation assay) للتلاعب بالتعبير الجيني في الخلايا السلفية لغشاء الجنين في الفأر.