Name: في Electroporation المختبر من شفة السفلى المعينية من أجنة الفئران Midgestation (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: تعلم تقنية الكهربة في المختبر لمعالجة التعبير الجيني في أجنة الفئران عند اليوم 11.5 من الحمل. تتيح هذه الطريقة استهداف الشفة المعينية السفلى لدراسة وظائف الجينات في تطور الدماغ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أود أن أشكر جين جونسون لNgn1، Math1، والأجسام المضادة Ptf1a وكوني Cepko لpCAG :: GFP البلازميد. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة 1R15HD059922 R15-01.

<ol><li>Ray, R. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rautenlippe+Redux+--+toward+a+unified+view+of+the+precerebellar+rhombic+lip%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Rautenlippe Redux -- toward a unified view of the precerebellar rhombic lip.</a> Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li>
<li>Wingate, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rhombic+lip+and+early+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The rhombic lip and early cerebellar development.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).</li>
<li>Wingate, R. J., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+rhombic+lip+in+avian+cerebellum+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">The role of the rhombic lip in avian cerebellum development.</a> Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).</li>
<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Development+of+Cerebellar+System%3A+In+relation+to+its+evolution%2C+structure%2C+and+function%22">Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function</a>. , CRC Press, Inc. Boca Raton. (1997).</li>
<li>Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+brainstem+cochlear+nuclear+complex+is+revealed+by+intersectional+and+subtractive+genetic+fate+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps.</a> Neuron. 50, 205-218 (2006).</li>
<li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li>
<li>Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+the+precerebellar+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Origin of the precerebellar system.</a> Neuron. 27, 475-486 (2000).</li>
<li>Taber-Pierce, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+nuclei+griseum+ponitis%2C+corporis+pontobulbaris+and+reticularis+tegmenti+pontis+%28bechterew%29+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse.</a> J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).</li>
<li>Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zic1+levels+regulate+mossy+fiber+neuron+position+and+axon+laterality+choice+in+the+ventral+brain+stem%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem.</a> Neuroscience. 162, 560-573 (2009).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li>
<li>Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classic+cadherins+regulate+tangential+migration+of+precerebellar+neurons+in+the+caudal+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain.</a> Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).</li>
<li>Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+nucleogenesis+by+precerebellar+neurons%3A+involvement+of+ventricle-directed%2C+radial+fibre-associated+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration.</a> Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).</li>
<li>Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+and+nucleogenesis+of+mouse+precerebellar+neurons+visualized+by+in+utero+electroporation+of+a+green+fluorescent+protein+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene.</a> Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).</li>
<li>de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+influences+on+the+migration+of+precerebellar+neurons+in+the+caudal+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla.</a> Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).</li>
<li>Landsberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindbrain+rhombic+lip+is+comprised+of+discrete+progenitor+cell+populations+allocated+by+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6.</a> Neuron. 48, 933-947 (2005).</li>
<li>Hoshino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a%2C+a+bHLH+transcriptional+gene%2C+defines+GABAergic+neuronal+fates+in+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum.</a> Neuron. 47, 201-213 (2005).</li>
<li>Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+climbing+fiber+neurons+and+their+developmental+dependence+on%5BTitle%5D)+AND+%22Ptf1a.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on.</a> Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وفي تقنية electroporation المختبر التي قدمت في هذه الدراسة هو منهج الرواية التي يمكن استخدامها بكفاءة لمعالجة الجينات في الأجنة الذين تقل أعمارهم عن 12 يوما من الحمل. وضع الأجنة في الثقافة يسمح التعبير عن الجينات المدخلة وتلتف على الفتك لاحظ عندما يسمح لأجنة electroporated أن تبقى في الجسم الحي. هذا الأسلوب يسمح للتلاعب في التعبير الجيني في الأسلاف الجنينية التي كان يتعذر الوصول إليها سابقا لelectroporation المستندة إلى دراسات. <p class="jove_content...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> ناظم البرد </td><td> لايكا </td><td> CM-1850 </td><td></td></tr><tr><td> تعامل البيولوجيا طرف Dumoxel دومون ملقط </td><td> العلمي أدوات غرامة </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20 ملعقة موريا ملم مثقوبة </td><td> العلمي أدوات غرامة </td><td> 10370-17 </td><td></td></tr><tr><td> ECM موجة مربع 830 Electroporation مولد </td><td> BTX (VWR) </td><td> 47745-928 </td><td></td></tr><tr><td> هارفارد جهاز Tweezertrodes 7 ملم * الأقطاب الكهربائية </td><td> BTX (فيشر) </td><td> BTX450165 </td><td></td></tr><tr><td> فيشر Isotemp CO 2 حاضنة </td><td> الصياد </td><td> 1325525 </td><td></td></tr><tr><td> نابكو ثاني منظم غاز 2 </td><td> الصياد </td><td> 15497020 </td><td></td></tr><tr><td> 12 زراعة الأنسجة حسنا لوحات </td><td> دينار بحريني الصقر (فيشر) </td><td> 877229 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone سائل الإعلام DMEM/F-12 (1:1)، مع الجلوتامين-L وHEPES؛ 500mL </td><td> الحرارية العلمية (فيشر) </td><td> SH3002301 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone * المانحة فرسي المصل </td><td> الحرارية العلمية (فيشر) </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> الأبقار مصل الجنين، ومؤهل، الحرارة المعطل </td><td> إينفيتروجن </td><td> 16140-063 </td><td></td></tr><tr><td> cellgro * 10،000 وحدة دولية البنسلين، 10000 ميكروغرام / مل الستربتوميسين </td><td> Mediatech (فيشر) </td><td> MT-30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> HyClone * L-L-الجلوتامين الجلوتامين، و 200mM في كلوريد الصوديوم 0.85٪ </td><td> الحرارية العلمية (فيشر) </td><td> SH3003401 </td><td></td></tr><tr><td> سريع والخضر </td><td> الصياد </td><td> AC41053-0250 </td><td> 0.01٪ </td></tr></tbody></table>

في electroporation المختبر من شفة السفلى المعينية من أجنة الفئران midgestation

In vitro Electroporation of the Lower Rhombic Lip of Midgestation Mouse Embryos

الشفة المعينية هو الظهارة العصبية الجنينية الموجودة في الدماغ المؤخر على مفترق الطرق بين الأنبوب العصبي وroofplate من البطين الرابع (استعرضت في 1). ويمكن تقسيم الشفة المعينية إلى الشفة العليا والمعينية (URL) الذي يضم قسيم معيني 1 (R1) وتولد الخلايا العصبية في المخيخ، والشفة السفلى المعينية (LRL) والذي يؤدي إلى تنوع السلالات الدماغ العصبية 2-4. وتشمل المشتقات LRL الخلايا العصبية السمعية من نوى القوقعة وتلك التابعة للنوى precerebellar التي تشارك في تنظيم التوازن والتحكم في المحركات 5-8. تكوين الخلايا العصبية من خلال LRL يحدث النافذة الزمنية الكبيرة التي تشمل أيام الجنينية (E) 9،5-16،5 5 و 9. الأنساب العصبية المختلفة على الخروج من LRL كخلايا تالية للتفتل (أو يولدون) خلال أيام تنموية متميزة خلال هذه النافذة العصبية. ويمكن استخدام Electroporation من بنيات التعبير الجيني للالتلاعب في التعبير الجيني في LRL الأسلاف، ويمكن تغيير محتمل في مصير الخلايا العصبية التي تنتج من هذه المنطقة 10-12. وكان تغيير الجينات من الأسلاف LRL في الماوس عبر في الرحم electroporation ناجحة للغاية لمعالجة الأنساب ولدت في يوم الجنينية E12.5 أو 10 في وقت لاحق، 12-14. في electroporations الرحم قبل E12.5 لم تكلل بالنجاح في المقام الأول نظرا ل الفتك المرتبطة ثقب roofplate البطين الرابع، خطوة ضرورية في تقديم الحمض النووي الخارجية التي يتم electroporated في LRL. ومع ذلك، فإن العديد LRL الأنساب المستمدة تنشأ من LRL في وقت سابق من E12.5 9. هذه النسب في وقت سابق من مواليد تشمل الخلايا العصبية التي تشكل شبكي الوحشي، الإسفينية الخارجية، ونوى الزيتونية السفلية للنظام precerebellar التي تعمل على ربط مدخلات من النخاع الشوكي والقشرة في المخيخ 5. من أجل التعامل مع التعبير في LRLمن الأجنة الذين تقل أعمارهم عن E12.5، قمنا بتطوير نظام 1 في المختبر في الأجنة التي يتم وضعها في الثقافة بعد electroporation. تقدم هذه الدراسة وسيلة فعالة وفعالة من أجل التلاعب في الجينات من الأسلاف LRL في E11.5. الأجنة electroporated مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP) طردوا من المروج CAG نشط على نطاق واسع وأعرب بتكاثر GFP بعد 24 ساعة من ثقافة. وهناك جانب حاسم من هذا الفحص هو أن يتم تبديل فقط التعبير الجيني بسبب التعبير عن الجينات خارجية وليس بسبب الآثار الثانوية التي تنتج عن electroporation وتقنيات زراعة. وقد تقرر أن أنماط التعبير الجيني الذاتية لا تزال دون عائق في الأجنة electroporated والمثقفين. ويمكن استخدام هذا الاختبار لتغيير مصير الخلايا الناشئة من LRL الأجنة الذين تقل أعمارهم عن E12.5 من خلال إدخال البلازميدات لoverexpression أو هدم (من خلال رني) من مختلف الموالية للعوامل النسخ العصبية.

هذه الدراسة توضح وضع<em&gt; في المختبر</em&gt; تقنية electroporation التي تسمح للتلاعب في التعبير الجيني في الشفة السفلى معيني الشكل من الأجنة midgestation.

في Electroporation المختبر من شفة السفلى المعينية من أجنة الفئران Midgestation

تعتبر الشفة المعينية ظهارة عصبية جنينية تقع في الدماغ الخلفي عند نقطة الالتقاء بين الأنبوب العصبي والصفيحة السقفية للبطين الرابع...

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحكم في التعبير الجيني في الخلايا السلفية للدماغ الخلفي الجنيني من خلال إدخال الحمض النووي البلازميدي عن طريق التثقيب الكهربائي في نقاط زمنية مبكرة من فترة الحمل. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الأجنة في اليوم 11.5 من الحمل وتوجيهها بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى في محلول ملحي منظم بالفوسفات معقم. والخطوة الثانية هي حقن حوالي 50 µL من بلازميد التعبير في 0.01% fast green.في حالة الحقن الناجح، سيمتلئ الجهاز البطيني بالكامل بخليط DNA fast green. بعد ذلك، يتم تعريض الجنين لنبضة كهربائية. وسيقوم جانب الجنين الأقرب إلى القطب الموجب بامتصاص الـ plasmid DNA.سيعمل الجانب الآخر كضابط سلبي داخلي. وتتمثل الخطوة النهائية في وضع الأجنة في مستنبت نسيجي لمدة 24 ساعة على الأقل. وفي النهاية، سيتم التعبير عن الجين الذي تم إدخاله كهربائيًا بعد 24 ساعة من الاستنبات، ويمكن تقييم ذلك عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية.تتمثل ميزة هذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في إمكانية التعامل مع أسلاف الدماغ الخلفي الجنينية في نقاط زمنية مبكرة من فترة الحمل. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في هذا المجال، مثل كيفية تأثير الجينات العصبية المختلفة على مصير الأسلاف الجنينية. ابدأ هذا الإجراء بتعقيم أدوات التشريح وغطاء التدفق الصفائحي وفقاً للمخطوطة المرفقة.لحصد الأجنة، ضع أنثى فأر تم قتلها رحيمًا وهي حامل في اليوم الجنيني E 11.5 على صينية التشريح داخل غطاء التدفق الصفحي. بعد ذلك، رش بطن الفأر بـ 70% ethanol. افتح التجويف البريتوني وثبّت الجدران بالدبابيس على صينية التشريح.ثم اسحب قرني الرحم بحيث يستقران داخل التجويف الصفاقي. وباستخدام الملقط، افتح جدار قرن الرحم بعناية. استخدم ملعقة بمقاس 20 millimeter لإزالة الأجنة الموجودة في الكيس المحي من المشيمة برفق.بعد ذلك، ضع الأجنة في طبق زراعة أنسجة مقاس 100 مليمتر، مملوء مسبقاً بـ 10 مليلتر من PBS بتركيز 1x معقم ومسخن مسبقاً. في هذه الخطوة، انقل الجنين الأول إلى طبق جديد مقاس 100 مليمتر مملوء مسبقاً بـ 10 مليلتر من PBS بتركيز 1x معقم ومسخن مسبقاً إلى 37 درجة مئوية.بعد ذلك، قم بإزالة كيس المح وكيس المح بعناية والتخلص منه. ثم ضع الجنين بحيث يكون الجانب الظهري متجهًا للأعلى. ثبت الجنين برفق باستخدام أقطاب كهربائية measuring 7 mm تحت مجهر تشريحي.ضع الأقطاب الكهربائية بحيث يكون كل قطب على أحد جانبي الأنبوب العصبي عند مستوى البطين الرابع في الدماغ الخلفي. بعد ذلك، استخدم حقنة سعة 1 cc لسحب خليط من الـ plasmid DNA و 0.01%Fast screen؛ وبشكل عام، يجب أن تكون 500 microliters من الخليط كافية لإجراء عملية التثقيب الكهربائي لـ 8 إلى 10 أجنة على الأقل. بعد ذلك، قم بثقب الصفيحة السقفية التي تعلو البطين الرابع برفق باستخدام إبرة توبيكولين مقاس 25 gauge وبطول five eighth متصلة بالحقنة سعة 1 CC.ثم يتم حقن حوالي 50 µL من خليط DNA DI في البطين. وتتميز عمليات الحقن الناجحة بملء خليط DNA DI للنظام البطيني بأكمله. وتتمثل وسيلة بديلة لإيصال خليط DNA DI في الوصول إلى النظام البطيني عن طريق ثقب الغشاء الشفاف الذي يغطي الدماغ المتوسط، ثم تشغيل مولد النبضات، وبعد ذلك يتم إيصال خمس نبضات مربعة باستخدام مولد نبضات كهربائي ومجاديف قطب كهربائي بحجم 7 mm في الأنسجة الأقرب إلى القطب الموجب الشحنة.بينما يتم تحضير البلازميد في غطاء تدفق صفائحي، املأ آبار طبق زراعة مكون من 12 بئراً بـ 2 mL من وسط DME MF 12 المدعم بـ 10% fetal bovine serum، و5% equine serum، و1% glutamine، و1% penicillin streptomycin، والذي تم تسخينه مسبقاً إلى 37 °C. بعد ذلك، أمسك الجنين من المنتصف باستخدام ملقط. قم بإزالة الجزء الخلفي من الجنين، ثم ضع الجزء الأمامي في أحد الآبار الممتلئة في طبق الزراعة.كرر الإجراء لجميع الأجنة واملأ الآبار الخارجية فقط من الطبق ذي الـ 12 بئراً. ولتجنب تلوث المزارع، يتم استزراع الأجنة في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C مع 5% carbon dioxide لمدة 24 ساعة للتعبير عن البلازميد الذي تم إدخاله عبر التثقيب الكهربائي. وفي حال الرغبة في فترة استزراع أطول، املأ الآبار في طبق 12 بئراً جديد بمقدار 2 mL من وسط D-M-E-M-F 12.انقل الأجنة باستخدام ملعقة معقمة إلى آبار طبق جديد. ثم أعدها إلى الحاضنة عند درجة حرارة 37 °C واستزرعها لمدة تصل إلى 48 ساعة لتثبيت الأجنة من أجل التحليل. املأ طبقاً ذا 12 بئراً بمحلول PBS بتركيز 1×، ثم انقل الأجنة واغسلها عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق.بعد ذلك، يتم تثبيت الأجنة في 2% paraldehyde في محلول PBS بتركيز 1x لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 °C. ثم تُشطف ثلاث مرات في محلول PBS بتركيز 1x عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق. ومرة أخرى، بعد ملء طبق جديد يحتوي على 12 بئراً بـ 30% sucrose في محلول PBS بتركيز 1x.انقل الأجنة إلى تلك الآبار واتركها لتتوازن طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، قم بتضمين الأجنة في مركب درجة حرارة القطع المثالية (OCT) باستخدام حمام من الإيثانول والثلج الجاف، أو قم بتخزينها عند درجة حرارة -20 °C. في النهاية، قم بتقطيع الأجنة إلى شرائح بسمك 30 micron باستخدام المقطاع بالتجميد (cryostat).ثبّتها على شرائح زجاجية واحفظها عند درجة حرارة -20 °C باستخدام uni Histochemical. تُظهر الدراسة اللاحقة المعروضة هنا النتائج التمثيلية لكيمياء الأنسجة المناعية لـ GFP في المقاطع المستعرضة لجنين E 11.5 تم إجراء التثقيب الكهربائي له بعد 24 ساعة من الزرع. تشير الأسهم الموضحة هنا إلى الصفيحة السقفية التي تحجز الأجسام المضادة الثانوية.تظهر النتائج أن المنطقة التي خضعت للتثقيب الكهربائي في الشفة السفلية لـ ROIC كانت محدودة ولم تمتد إلى كامل المحور الأمامي الخلفي للأنبوب العصبي. وهنا تظهر النتائج لبروتينين من البروتينات التي تم تحليلها وهما MASH one و math one. وقد لاحظنا أن غالبية الأجنة احتفظت بمستويات تعبير طبيعية بعد التثقيب الكهربائي والاستزراع مقارنة بالأجنة الضابطة عند المرحلة 11.5. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون ساعة إلى ساعتين إذا نُفذت بشكل صحيح.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية استخدام مقايسة التثقيب الكهربائي في المختبر (in vitro electroporation assay) للتلاعب بالتعبير الجيني في الخلايا السلفية لغشاء الجنين في الفأر.

in-vitro-electroporation-lower-rhombic-lip-midgestation-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

في الرحم وحقن داخل البطيني Electroporation من أجنة الفئران E15

هنا نقدم اثنين من التقنيات لمعالجة الجينات في خلايا الفئران العقدة الشبكية (RGCs) من...

Electroporation في الجسم الحي وخارج الرحم للتعبير الجينات في خلايا الشبكية العقدة ماوس

وهناك طريقة لدمج الحمض النووي في خلايا الشبكية البلازميد الفئران لغرض تنفيذ إما مكسب أو خسارة للدراسات...

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

يوصف أسلوب نقل الجينات في مخ الفأر النامية باستخدام أسلوب فريد الجراحية وشكل خاص من الأقطاب الكهربائية. هذا الأسلوب الفريد يسمح ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد الزمان والمكان ، والتي ستساعد الكثير من علماء الأعصاب في دراسة تطور الدماغ.

فأر في الرحم Electroporation : الشواهد ترنسفكأيشن جين Spatiotemporal

السيطرة على التوسع في الخلايا الجذعية الجسدية هو أحد العوامل الرئيسية التي تعوق دراستهم واستخدامها في العلاج. نحن هنا وصف نظام للسيطرة على التوسع زمنيا العصبية خلال الخلايا الجذعية التنمية والبلوغ، والتي يمكن استخدامها لزيادة عدد الخلايا العصبية في الدماغ ولدت الماوس.

توسيع الجنينية والكبار الخلايا الجذعية العصبية من قبل<em&gt; في الرحم</em&gt; الصعق الكهربائي أو حقن التجسيمي الفيروسية

وعلى الرغم من أهمية وظيفية والطبية من منطقة ما تحت...

التلاعب الجيني من الفأرة النامية من خلال المهاد<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

نعرض طريقة لتطعيم الخلايا المزروعة في مواقع محددة من أجنة الفئران المبكرة لتحديد إمكاناتها في الجسم الحي. نقدم أيضا طريقة كهربائية محسنة تستخدم الشعيرات الدموية الزجاجية ذات القطر المعروف ، مما يسمح بالتوصيل الدقيق للحمض النووي الخارجي إلى عدد قليل من الخلايا في الأجنة.

طرق لنقل المترجمة على وجه التحديد من الخلايا أو الحمض النووي في Postimplantation المبكر أجنة الفئران

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية نقل مناطق مختلفة على وجه التحديد في الجهاز العصبي المركزي C57BL / 6 عبر التثقيب الكهربائي في الرحم. يتضمن هذا البروتوكول تعليمات مفصلة لتعدي المناطق التي تتطور إلى القشرة ، والحصين ، والمهاد ، ومنطقة ما تحت المهاد ، ونواة الحاجز الجانبي ، والمخطط.

Cortex-، Hippocampus-، Thalamus-، Hypothalamus-، الجانبي الحاجزي Nucleus- والمخطط محددة<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation للفي C57BL / 6 الماوس

مضاعفة في الكهربائي الرحم يسمح استهداف مجموعات الخلايا التي يتم فصل مكاني وزمنيا. هذه التقنية مفيدة لتصور التفاعلات بين تلك الخلايا التي تستخدم البروتينات الفلورية في الظروف العادية ولكن أيضا بعد التجارب الوظيفية ل الجينات التي تثير الاهتمام.

مضاعفة في Electroporation الرحمية لاستهداف مجموعات الخلايا المنفصلة زمانياً ومكانياً

نصف هنا طريقة محددة زمنيا للتعامل بفعالية مع المسارات التنموية الحرجة في مشيمة الفأر في الجسم الحي. يتم إجراء ذلك من خلال الحقن والتثقيب الكهربائي لبلازميدات كريسبر في مشيمة السدود الحامل في اليوم الجنيني 12.5.

الماوس في الجسم الحي المشيمة المستهدفة كريسبر التلاعب

تعلم تقنية الكهربة في المختبر لمعالجة التعبير الجيني في أجنة الفئران عند اليوم 11.5 من الحمل. تتيح هذه الطريقة استهداف الشفة المعينية السفلى لدراسة وظائف الجينات في تطور الدماغ.

في Electroporation المختبر من شفة السفلى المعينية من أجنة الفئران Midgestation

استكشف المزيد من الفيديوهات