Name: Oct4GiP الفحص مراسل لدراسة الجينات التي تنظم الفأر الخلايا الجذعية الجنينية الصيانة والتجديد الذاتي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: اكتشف تقنية الفحص المراسل الفلوري لتحديد دور الجينات في صيانة الخلايا الجذعية الجنينية للفأر وتجديدها الذاتي باستخدام تحليل التدفق الخلوي. هذه الطريقة تتيح تقييمًا سريعًا لوظيفة الجينات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر براد Lackford لقراءة وتحرير مخطوطة. وأيد هذا البحث من قبل المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية، المعاهد الوطنية للصحة برنامج بحوث ضمن الجدران Z01ES102745 (إلى GH).

1. Oct4GiP خلية ES الفأر الصيانة تفضلت الخلايا Oct4GiP الدكتور أوستن سميث. كانت مشتقة من الفئران 129/Ola يحمل التحوير Oct4-GFPiresPac 4،5. يتم الاحتفاظ بها في الجيلاتين المغلفة لوحات زراعة الأنسجة في المتوسط ​​ESGRO درجة كاملة زائد نسيلي (ميليبور)، أو في المدى المتوسط ​​M15: DMEM (إينفيتروجن) تستكمل مع FBS 15٪، 1000 يو / مل ESGRO (ميليبور)، 1X غير الأحماض الأمينية الأساسية (إينفيتروجن)، 1X EmbryoMax Nucleasides (ميليبور)، و 10 ميكرومتر β-المركابتويثانول. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات معطف مع الجيلاتين 0.1٪ (سيغما) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة (0.1 مل الجيلاتين حل / سم 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا Oct4GiP صفيحة الجيلاتين في مغلف بالمطاط في لوحات ~ 2 × 10 4 / سم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقسام الخلايا كل يومين مع التربسين 0.05٪. </li></ol> 2. ترنسفكأيشن سيرنا في خلايا Oct4GiP الفحص مراسل Oct4GiP هو الأكثر ملاءمةنفذت tly في الجيلاتين المغلفة مسطحة القاع 96 - 384 أو جيدا لوحات (كورنينج أو دينار بحريني) في المتوسط ​​M15. ويرد الإجراء شامل في الشكل 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيرنا، دهن المجمعات الجمعية العمومية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لترنسفكأيشن في 96-جيدا لوحات، وتجمع الدهون المجمعات سيرنا، في U-96-أسفل جيدا لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كل بئر، خلط 10 OptiMEM ميكروليتر (إينفيتروجن) و 0.3 Lipofectamine ميكرولتر 2000 (إينفيتروجن)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 سيرنا بمول إلى خليط للدهون، OptiMEM واحتضان لمدة 15 دقيقة. وسيرنا: نسبة الدهون هو 100 بمول: 6ul. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المجمعات سيرنا-الدهون في OptiMEM من لوحة U-أسفل لوحة مسطحة القاع الجيلاتين المغلفة مع ماصة متعدد القنوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لترنسفكأيشن في 384 جيدا لوحات، وإعداد المجمعات سيرنا-الدهون باستخدام 0.1 ميكرو لتر Lipofectamine 2000 و 2 بمول سيرنا في 10 OptiMEM ميكرولتر. </li></ol></li></ol> ملاحظة: إن تركيز سيرنا في النهائيوtransfections هو 50 نانومتر. تنفيذ البيولوجية 3-4 مكررات لكل ترنسفكأيشن سيرنا. إعداد الخلائط ماجستير في المجمعات سيرنا-الدهون في لوحة تحت القاع وقسامة في لوحة الجيلاتين المغلفة مسطحة القاع. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oct4GiP طلي الخلية وترنسفكأيشن: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لترنسفكأيشن في 96-جيدا لوحات، وجمع الخلايا Oct4GiP وresuspend منهم في المتوسط ​​M15 جديدة ل9 × 10 4 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 100 ميكرولتر من التعليق على كل خلية جيدا باستخدام ماصة متعدد القنوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط تعليق خلية مع المجمعات سيرنا، الدهون قبل aliquoted في البئر بواسطة pipeting صعودا وهبوطا 3-5 مرات. نصائح لتغيير transfections سيرنا مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لترنسفكأيشن في لوحات 384 بشكل جيد، وخلايا Oct4GiP resuspend إلى 6 × 4 10 خلية / مل وقسامة 30 تعليق خلية ميكروليتر إلى كل بئر. </li></ol></li></ol> ملاحظة: تصفيح الخلية الأمثل كثافة عادة ما يكون 3 × 10 5 خلية / سم 2، ولكن مAY تتطلب مزيدا من التحسين siRNAs أن تؤثر بشكل كبير في نمو الخلايا أو قدرتها على البقاء. ومنخفض الكثافة الطلاء يؤدي إلى بقاء الخلية الفقراء خلال ترنسفكأيشن. وارتفاع كثافة الطلاء يؤدي إلى خلفية عالية نظرا لارتفاع خلية التمايز بفعل التقاء. إذا كان ذلك ضروريا تصفيح اختبار، والكثافة بين 2-4 خلايا س 5 10 / سم 2. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسط ​​التغير: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة القديمة باستخدام متعدد القنوات الشافطة (كورنينج) أو فراغ عصا (VP-العلمي). يجب الحرص على عدم خدش الخلايا في الجزء السفلي من لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغذية الخلايا مع الطازجة وفاق متوسط ​​خلية (100 ميكروليتر لوحة 96-جيدا وميكرولتر 30 ل384 لوحة جيد) باستخدام متعدد القنوات ماصة كل يوم. </li></ol></li></ol> 3. تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلية تفكك: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أربعة أيام من ترنسفكأيشن، وإزالة المتوسطة باستخدام متعدد القنوات الشافطة (كورنينج) أو فراغ عصا (VP-العلمي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل96-جيدا لوحات، وشطف الخلايا مرة واحدة مع 100μل PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 ميكرولتر التربسين 0.25٪ على كل جيدا باستخدام ماصة متعدد القنوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في درجة حرارة الغرفة ل5minutes مع الإثارة في بعض الأحيان، وفحص البصر لضمان حياد تام للخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع FBS 10٪ لإبطال نشاط التربسين وفصل الخلايا في تعليق خلية واحدة بواسطة pipetting المتكررة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل384 جيد لوحات، وتنأى الخلايا مع 10 ميكرولتر التربسين وإخماد مع 30 PBS ميكرولتر مع FBS 10٪. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل مضان GFP على محلل دينار بحريني FACS LSRII مجهزة وحدة HTS أو غيرها من محلل نظام مراقبة الأصول الميدانية مجهزة على نحو مماثل (مثل Accuri أو Intellicyt). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام وضع الإنتاجية العالية على HTS وتحليل 10 ميكرولتر من التعليق الخلية. تعيين العتبة عدد الخلايا إلى 1.0 X 4 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الجهد PMT وعتبة للقبض على خلايا في المؤامرة إلى الأمام في مقابل الجانب مبعثر. بوابة للسكان الخلية الحية في forwارض مقابل الجانبية مبعثر مؤامرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلق مؤامرة الرسم البياني للقناة GFP. تعيين البوابة في قناة GFP بحيث ~ 10٪ من الخلايا على ما يبدو GFP سلبية في الخلايا transfected وهمية أو سيطرة سيرنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد٪ GFP سلبية الخلايا من كل معاملة: الخلايا المتمايزة٪ =٪ GFP سلبية الخلايا. مقارنة بين الخلايا٪ فرق بين التجريبية وtransfections ضبط سيرنا باستخدام 2 الذيل اختبار t، ويسجل مشاهدات ايجابية مع القيم ف &lt;0.01. </li></ol></li></ol> 4. ممثل النتائج Oct4، نانوغ (NANOG) وSox2 ثلاثة الجينات التي تلعب دورا حاسما في الحفاظ على خلايا ES الذاتي تجديد 6،7،9-11. الشكل 2 يبين أن مقايسة مراسل Oct4GiP يمكن الكشف بسهولة التفريق بسبب إسكات هذه العوامل في Oct4GiP خلايا ES. رقم 2A يبين خلايا ES Oct4GiP GFP هي إيجابية عندما حافظت على وفاق<html> الخلايا. الشكل 2B يبين مؤامرة مبعثر إلى الأمام في مقابل الجانب والرسم البياني للقناة GFP من الخلايا Oct4GiP transfected مع ضبط أو Oct4 siRNAs. فمن الضروري بوابة للخلايا الحية في مؤامرة مبعثر إلى الأمام في مقابل الجانب، حيث أن الخلايا الميتة والبقايا هي GFP سلبية وستزيد من الخلفية. لا من ناحية أخرى، صدرة ضيقة التمييز لاستبعاد كتل الخلية ممكن حاجة دائما. في الخلايا ضبط سيرنا transfected، ينبغي أن الغالبية العظمى من الخلايا تكون GFP إيجابية. إذا واضح GFP سلبية السكان موجودة في آبار ضبط سيرنا transfected، قد يكون تم الخلايا Oct4GiP بدء أو إجراء ترنسفكأيشن للخطر والنتيجة قد لا تكون للتفسير. الشكل 2C يظهر في الرسم البياني شريط من الخلايا المتمايزة٪ (الخلايا المتمايزة٪ =٪ GFP سلبية خلايا) من التحكم، Oct4، Nanog، وSox2 سيرنا خلايا transfected. <html> d/3987/3987fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. الخطوط العريضة للOct4GiP مقايسة مراسل. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3987/3987fig2.jpg" /> الشكل 2. يمكن Oct4GiP فحص كشف مراسل ES تمايز الخلايا التي تسببها نانوغ (NANOG) Oct4، أو إسكات Sox2. أ) تم تحليل E14Tg2a (من النوع البري، خط أسود) والخلايا Oct4GiP (الخط الأخضر) من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية. رسم بياني للقناة GFP يدل على أن الخلايا Oct4GiP هي GFP إيجابية. ب) تم transfected الخلايا Oct4GiP في 96-جيدا لوحات مع التحكم أو Oct4 سيرنا، ونظام مراقبة الأصول الميدانية تحليلها بعد 4 ايام ترنسفكأيشن. وtransfected إلى الأمام مقابل المؤامرات مبعثر جانب ورسوم بيانية للقناة GFP من الخلايا transfected ترد. C) الخلايا Oct4GiP مع التحكم، Nanog، Oct4، أو Sox2-سيرنا. تم تحديد الخلايا المتمايزة٪ من٪ GFP سلبية الخلايا بعد 4 ايام ترنسفكأيشن، وتآمر كما يعني + / - الخطأ المعياري للمتوسط ​​(ن = 4).و = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg&quot; الهدف = &quot;_blank&quot;&gt; اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

<ol><li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+differentiation%3A+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li>
<li>Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+potency+by+spontaneous+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changing potency by spontaneous fusion.</a> Nature. 416, 545-548 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Nichols, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+pluripotent+stem+cells+in+the+mammalian+embryo+depends+on+the+POU+transcription+factor+Oct4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.</a> Cell. 95, 379-391 (1998).</li>
<li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+of+Oct-3%2F4+defines+differentiation%2C+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li>
<li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+cloning+of+Nanog%2C+a+pluripotency+sustaining+factor+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells.</a> Cell. 113, 643-655 (2003).</li>
<li>Masui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+governed+by+Sox2+via+regulation+of+Oct3%2F4+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).</li>
<li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li>
<li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li>
<li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li>
<li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+embryonic+stem+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li>
<li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li>
<li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

لا يمكن للمقايسة مراسل Oct4GiP وصفنا أعلاه قياس كميا مدى التجديد الذاتي مقابل التمايز. بالمقارنة مع الطرق الأخرى المتاحة، مثل ال 12 مورفولوجيا القاعدة والانتشار / البقاء القائم على المقايسات، فإنه يوفر أعلى حساسية والإنتاجية، فضلا عن قياس أكثر مباشرة للدولة وفاق الخلية. ولذلك يجعلها مناسبة جدا لنطاق واسع الشاشات وراثية تحليل قشوة. في الواقع، لقد كنا وغيرها بنجاح فحص مراسل Oct4GiP لشاشات رني الجينوم على نطاق 3،8. مثل جميع المقايسات، ومع ذلك، كما أن لديها قيود....

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> ESGRO متوسط ​​درجة كاملة زائد نسيلي </td><td> ميليبور </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (الجلوكوز السامية 1X) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> 0.25٪ التربسين-EDTA </td><td> إينفيتروجن </td><td> 25200 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> إينفيتروجن </td><td> 1001817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (خفض متوسط ​​المصل) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> ESGRO mLIF (10 7 units/1ml) </td><td> ميليبور </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA (غير الضرورية الأحماض الأمينية) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> 100X النيوكليوسيدات لخلية ES </td><td> ميليبور </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> 2-المركابتويثانول </td><td> سيغما </td><td> M7522-100ML </td></tr><tr><td> ES-المؤهلين مصل بقري جنيني </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10437 </td></tr><tr><td> Nanog سيرنا </td><td> إينفيتروجن </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 سيرنا </td><td> Dharmacon </td><td> D-046256-02 </td></tr><tr><td> Sox2 سيرنا </td><td> Dharmacon </td><td> M-058489-01 </td></tr></tbody></table> سيرنا السيطرة: مزدوج سيرنا استهداف يراعة luciferase المراسل (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) توليفها من قبل Dharamcon.

oct4gip الفحص مراسل لدراسة الجينات التي تنظم الفأر الخلايا الجذعية الجنينية الصيانة والتجديد الذاتي

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

تعدد القدرات الذاتية والتجديد هما الخصائص المميزة للخلايا الجذعية الجنينية (خلايا ES). وفهم الآلية الجزيئية الكامنة وراء يسهل إلى حد كبير على استخدام خلايا ES لدراسات البيولوجيا التطورية، والنمذجة المرض، واكتشاف المخدرات، والتجدد الطب (استعرضت في 1،2). إلى الإسراع في تحديد وتوصيف المنظمين رواية من خلية وفاق وصيانة النفس التجديد، قمنا بتطوير مضان مراسل القائم على فحص لقياس كمي لوضع الذات في تجديد خلايا ES فأر باستخدام خلايا Oct4GiP 3. الخلايا Oct4GiP تعبر عن ببروتين أخضر (GFP) في إطار السيطرة على المنطقة الجين المروج Oct4 4،5. مطلوب Oct4 لخلية ES الذاتي تجديد، ويعبر عنه بشكل كبير في الخلايا وفاق وسرعان ما انهارت التنظيم خلال التمايز 6،7. ونتيجة لذلك، GFP التعبير ومضان في الخلايا مراسل يرتبط بأمانةمع وفاق هوية الخلية 5، ومضان تنشيط الخلايا ويمكن فرز (FACS) يمكن استخدام التحليل أن تراقب عن كثب الوضع الذاتي تجديد الخلايا على مستوى خلية واحدة 3،8. مقرونا رني، يمكن استخدام الفحص مراسل Oct4GiP إلى التعرف بسرعة ودراسة المنظمين من صيانة الخلية وفاق والذاتي تجديد 3،8. بالمقارنة مع الطرق الأخرى لمعايرة الذاتي تجديد، وهو أكثر ملاءمة، الحساسة، والكمية، وأقل تكلفة. ويمكن القيام بها في 96 - أو 384 كذلك لوحات لدراسات واسعة النطاق مثل شاشات عالية الإنتاجية أو وراثية تحليل قشوة. أخيرا، وذلك باستخدام خطوط أخرى ES مراسل خلية نسب محددة، ويمكن أيضا للفحص وصفنا هنا يمكن تعديلها لدراسة مواصفات مصير خلال تمايز الخلايا ES.

نحن وصفا لفحص مراسل مضان على التعرف بسرعة وتوصيف الجينات التي تنظم الماوس الخلايا الجذعية الجنينية وصيانة وتجديد النفس.

Oct4GiP الفحص مراسل لدراسة الجينات التي تنظم الفأر الخلايا الجذعية الجنينية الصيانة والتجديد الذاتي

تُعد تعدد القدرات (Pluripotency) والتجدد الذاتي صفتين محددتين للخلايا الجذعية الجنينية (ES cells). ومن شأن فهم الآلية الجزيئية الكامنة وراء ذلك أن...

الهدف العام من التجربة التالية هو التحديد السريع لدور الجين المستهدف في الحفاظ على التجدد الذاتي للخلايا الجذعية الجنينية للفأر أو خلايا ES. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير المزيج الرئيسي لعملية عفن الخلية (transfection master mix) الذي سيُستخدم لإسكات الجينات المستهدفة. وكخطوة ثانية.يُنقل الخليط الرئيسي لعملية عفن الخلايا (transfection master mix) إلى طبق مطلٍ بالجيلاتين، ثم تُضاف خلايا T 4G IP. بعد ذلك، تُزرع الخلايا في ظروف زراعة خلايا ES العادية للسماح بظهور تأثير إسكات الجين. وبعد أربعة أيام من الزراعة، تُفصل الخلايا عن الطبق ويتم تحديد حالة التجدد الذاتي لها بواسطة قياس التدفق الخلوي (flow cytometry). وفي النهاية، يمكن تقييم الاختلافات في النسبة المئوية للخلايا السالبة لـ GFP بين خلايا T 4G IP الضابطة وتلك التي تم عفنها بـ siRNA التجريبي باستخدام تحليل التباين (ANOVA).تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تحليل مورفولوجيا الخلايا أو تحليل علامات السلالة، في توفيرها حساسية وإنتاجية أعلى، مما يجعلها أكثر ملاءمة للفحوصات الجينية متوسطة إلى واسعة النطاق أو تحليل التفاعل الجيني (genetic epistasis). ويمكن لهذه الطريقة أن تسهل بشكل كبير دراسة أهمية الجينات في الحفاظ على خلايا ESL وتجددها الذاتي. كما يمكن تكييفها لدراسة أحداث التخصيص الذاتي التي تحدث أثناء تمايز خلايا ESL.يتم الحفاظ على خلايا T 4G IP في أطباق مطلية بالجيلاتين. وتُزرع بكثافة تبلغ حوالي 2 × 10⁴ سم²، ويتم تمريرها كل يومين إلى ثلاثة أيام لغرض عفن التحول (transfection). في أطباق ذات 96 بئراً وقاع مسطح، ابدأ بطلاء الطبق بـ 0.1% جيلاتين، ثم قم بتحضير الخليط الرئيسي من Optum و Lipectomy 2000 وتوزيعه في أطباق ذات 96 بئراً وقاع على شكل حرف U.قم بتحضين الطبق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم أضف خمس picomoles من I a إلى خليط الليبيد الأمثل وقم بالتحضين لمدة 15 دقيقة أخرى. بعد ذلك، قم بإزالة الجيلاتين من طبق القاع المسطح ذو الـ 96 بئراً، واستخدم ماصة متعددة القنوات لنقل معقدات i a الليبيدية في الوسط الأمثل من طبق القاع على شكل حرف U إلى أطباق القاع المسطح. الآن، قم بجمع خلايا OC 4G IP وأعد تعليقها في وسط M 15 طازج بتركيز تسعة × 10⁴ خلية لكل milliliter.بعد ذلك، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 100 µL من معلق الخلايا إلى كل بئر في طبق ذي قاع مسطح يحتوي على 96 بئراً، ثم قم بالماصة صعوداً وهبوطاً من ثلاث إلى خمس مرات لخلط معلق الخلايا مع معقدات السيرأليبيد (seralipid complexes)، مع تغيير الرؤوس عند استخدام سيرأليبيدات (seralipids) مختلفة لعملية عفن الخلايا (transfection). ثم ضع الأطباق في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C و5% carbon dioxide وازرع الخلايا لمدة أربعة أيام. وفي كل يوم من أيام الزرع، استخدم جهاز شفط متعدد القنوات لإزالة الوسط القديم، مع الحرص على عدم خدش الخلايا الموجودة في قاع الأطباق.بعد ذلك، استخدم ماصة متعددة القنوات لتغذية الخلايا بـ 100 microliters من وسط خلايا ES الطازج بعد أربعة أيام من عملية عفن الخلايا (transfection). قم بإزالة الوسط باستخدام جهاز شفط متعدد القنوات واغسل الخلايا مرة واحدة بـ 100 microliters من PBS. ثم استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 25 microliters من 0.25%tripsin إلى كل منها.يتم تحضين الخلايا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الرج من حين لآخر. بعد ذلك، يتم فحص الطبق بصرياً للتأكد من انفصال الخلايا تماماً. بعد انفصال الخلايا، أضف 90 µL من PBS مع 10% FBS لإيقاف مفعول التربسين، ثم اسحب محلول الخلايا بالماصة للأعلى والأسفل عدة مرات لتفكيك الخلايا إلى معلق من الخلايا المفردة.أخيرًا، استخدم وضع الإنتاجية العالية في وحدة HTS بجهاز محلل FACS لتحليل 10 µL من معلق الخلايا. اضبط حد العد على 1.0 × 10⁴ خلية، وقم بتعديل جهد PMT لالتقاط الخلايا في مخطط التشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي. ابدأ بوضع بوابة التحليل لمجتمع الخلايا الحية في مخطط التشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي، ثم أنشئ مخططًا تكراريًا لقناة GFP.يتم ضبط البوابة في قناة GFP بحيث يظهر حوالي 10% من الخلايا كخلايا سالبة لـ GFP في الخلايا التي خضعت لعملية transfection وهمية أو ضابطة باستخدام SINA، ومن ثم يتم تحديد النسبة المئوية للخلايا المتمايزة بناءً على النسبة المئوية للخلايا السالبة لـ GFP لكل معالجة. قارن النسبة المئوية للخلايا المتمايزة بين المجموعات التجريبية والمجموعات الضابطة التي خضعت لعملية transfection بـ irna.يوضح الشكل الأول أن خلايا E 14 TG two A من النوع البري، والتي يمثلها المدرج التكراري الأسود، سالبة لـ GFP، بينما خلايا T 4G IP، التي يمثلها المدرج التكراري الأخضر، موجبة لـ GFP عند الحفاظ عليها كخلايا ES. وفي الشكلين التاليين، تظهر مخططات التشتت الأمامي مقابل الجانبي والمدرجات التكرارية لقناة GFP لخلايا T 4G IP بعد أربعة أيام من عفنها باستخدام siRNA تحكم أو T four siRNAs في مخططات التشتت. يتم أولاً تحديد الخلايا الحية في مخطط التشتت الأمامي مقابل الجانبي لأن الخلايا الميتة والحطام تكون سالبة لـ GFP وتزيد من الخلفية كما هو موضح في بيانات المدرج التكراري؛ وفي الخلايا المعفنة بـ irna التحكم، تكون الغالبية العظمى من الخلايا موجبة لـ GFP.توضح هذه الرسوم البيانية الشريطية النسبة المئوية للخلايا المتمايزة من خلايا التحكم، وخلايا nano OCT four وSOX two التي تم نقل siRNA إليها، وخلايا OCT 4G IP بعد أربعة أيام من عملية النقل. وكما هو متوقع في جميع الحالات، تبين أن الخلايا التي تم نقل siRNA إليها تظهر مستويات تمايز أعلى من مجموعات التحكم. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها خلال ساعة واحدة من العمل التطبيقي لكل لوحة ذات 96 بئراً.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام مقايسة Oxford GIP reporter لتحديد دور الجين محل الاهتمام في الحفاظ على الخلايا الجذعية للجريبات البصيلية (ESL) في الفأر بشكل سريع.

oct4gip-reporter-assay-to-study-genes-that-regulate-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذا الفيديو يبين الداخلي الناجم عن توليد الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام الفيروسة البطيئة التي تعبر عن محرض Oct4 ، Sox2 ، ج Myc وKlf4.

توليد خلايا الجذع من خلال التعبير MEFS القسري لل2 - سوكس ، أكتوبر 4 ، ج Myc وKlf4

يمكن للمحرض دوكس Stemgent ماوس TF تعيين الفيروسة البطيئة إعادة برمجة الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) إلى الخلايا المحفزة التي يسببها (آي بي إس) الجذعية. نحن هنا لشرح بروتوكول للDOX - محرض التعبير من العوامل الماوس النسخ برمجة Oct4 ، Sox2 ، وKlf4 ج Myc إلى توليد المستعمرات التي تعبر عن الجذع المشترك علامات MES تعدد القدرات.

جيل من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عامل النسخ أربعة ، والدوكسيسيكلين محرض Lentiviral نظام تنبيغ

وظائف عن طريق تثبيط SC1 المزدوج للرأس وجاب ERK1. نحن اختبار وظيفة SC1 في دعم خلية فأر ES التجديد الذاتي في غياب LIF وأظهرت أن SC1 غير قادرة على الحفاظ على الذات تجديد الخلايا ES الثقافات الماوس.

استخدام SC1 (Pluripotin) لدعم MESC التجديد الذاتي في غياب LIF

يوضح هذا الفيديو تقنية لتقييم نشاط حمض الريتينويك في أجنة الفئران. عند عزل الخلايا عن أجنة الفئران ، يتم زراعة الخلايا بشكل مشترك مع خلايا مراسل حمض الريتينويك (RA). تنتج الخلايا الجنينية التهاب المفاصل الروماتويدي ، الذي يحفز تعبير بيتا جالاكتوزيداز في الخلايا المراسلة ، مما يشير إلى نشاط التهاب المفاصل الروماتويدي في الخلايا الجنينية.

توظيف خلايا المراسل في ثقافة مشتركة لدراسة إنتاج حمض الريتينويك بواسطة الخلايا الجنينية للفأر

وهناك حاجة واحدة الجين الخلية التعبير مقايسة لفهم التغاير الخلايا الجذعية.

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

في هذه الدراسة ، نقوم بإنشاء خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات من خلايا السائل الأمنيوسي للفأر ، باستخدام نظام ينقولات غير فيروسيا.

إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة من الفأر الأمنيوسي الخلايا السوائل عن طريق نظام ينقول

هنا، نقدم بروتوكول الكمي وقابلة للتنفيذ لأداء شاشات جزيئات صغيرة المستهدفة للمنظمين كيناز للتحول متعدد القدرات السذاجة تستعد.

طريقة بسيطة لتحديد الحركات التي تنظم تعدد القدرات الجذعية للخلايا الجذعية من خلال فحص المانع عالي الإنتاجية

وصفت لنا بالتفصيل البروتوكولين على أساس المادة الكيميائية لاستزراع الخلايا الجذعية الجنينية الماوس. ويستخدم هذا الأسلوب الجديد التآزري آليات تعزيز أكسدة تيت بوساطة (بفيتامين ج) وقمع حيثياته توليف 5-ميثيلسيتوسيني (حسب PD0325901) للحفاظ على الحمض النووي هيبوميثيليشن وبلوريبوتينسي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس.

أسلوب ثقافة بديلة للحفاظ على هيبوميثيليشن الجينية للخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام مجاهدي خلق مثبطات PD0325901 وفيتامين (ج)

يقيس هذا البروتوكول بشكل كمي استقرار ونصف عمر الحمض النووي الريبي المعزز بين الجينات وداخل الوراثة في الخلايا الجذعية الجنينية للفئران باستخدام علاج الأكتينومايسين D، وRT-qPCR، وتحليل الانحدار غير الخطي. يتم دمج استراتيجيات تطبيع خاصة بالموقع لنمذجة ديناميكيات تحلل eRNA بدقة بطريقة تعتمد على السياق.

التقييم الكمي الأمثل لاستقرار الحمض النووي الريبي المعزز في الخلايا الجذعية الجنينية للفئران

يوفر هذا البروتوكول خط أنابيب حسابيا مبسطا لقياس نصوص المحسن الوليدة. من خلال دمج إمكانية الوصول إلى الكروماتين وميزة الكروماتين وبيانات النسخ ، فإنه يتيح الكشف الدقيق والتحليل الخاص بالخيوط لنشاط المحسن في المناطق المعقدة داخل الجينات ، مع الحفاظ على إمكانية الوصول إلى الباحثين دون تدريب مكثف على المعلوماتية الحيوية.

خط أنابيب حسابي لقياس كمية الحمض النووي الريبي المحسن بين الجينات / داخل الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية للفئران

اكتشف تقنية الفحص المراسل الفلوري لتحديد دور الجينات في صيانة الخلايا الجذعية الجنينية للفأر وتجديدها الذاتي باستخدام تحليل التدفق الخلوي. هذه الطريقة تتيح تقييمًا سريعًا لوظيفة الجينات.

Oct4GiP الفحص مراسل لدراسة الجينات التي تنظم الفأر الخلايا الجذعية الجنينية الصيانة والتجديد الذاتي

استكشف المزيد من الفيديوهات