التصور والتحليل من تدفق الدم واستهلاك الأكسجين في دوران الأوعية الدقيقة كبدي: تطبيق نموذج لالتهاب الكبد الحاد

تم تطوير نظام بصري لتصور الدورة الدموية الدقيقة في الكبد باستخدام كريات دم حمراء موسومة بفلورسنت، ولقياس الضغط الجزئي للأكسجين في الأوعية الدقيقة باستخدام التصوير الفسفوري المدعوم بالليزر. يمكن استخدام هذه الطريقة لاستقصاء الآليات الفسيولوجية والمرضية من خلال تحليل بنية الأوعية الدقيقة، وقطرها، وسرعة تدفق الدم، والتوتر الأكسجيني. وفي الدورة الدموية الدقيقة للكبد، يتدفق الدم من الجيوب الوريدية البابية إلى الجيوب الوريدية المركزية، مما يخلق تدرجاً في الأكسجين بين الاثنين.

يؤثر تركيز الأكسجين في الكبد على كل من التعبير الإنزيمي والباثولوجيا، مما يجعل تحليل تدفق الدم وقياس الأكسجين من الموضوعات البحثية الهامة. تتضمن طريقتنا التجريبية حقن خلايا دم حمراء معلمة بفلورسنت عن طريق الوريد.

من أجل تصور الدورة الدموية الدقيقة باستخدام الفلورة لقياس الضغط الجزئي للأكسجين، نقوم بحقن البورفيرين باللاديوم وريدياً، والذي يبعث فسفورية في مجرى الدم عند استثارته بواسطة الليزر بدرجة تعتمد على تركيز الأكسجين المحيط. تتيح هذه العملية تحليلاً كمياً للأكسجين؛ حيث أظهر قياس الضغط الجزئي للأكسجين في الدورة الدموية الدقيقة للكبد أن الضغط الجزئي للأكسجين في الوريد البابي والوريد المركزي كان 59.8 و 38.9 millimeters of mercury على التوالي، مما يثبت القياس الفعال لتركيز الأكسجين. بعد ذلك، طبقنا هذه المنهجية على نموذج لالتهاب الكبد.

وجدنا ارتفاعاً في الضغط الجزئي للأكسجين في الجيوب الفصيصية البابية والوريدية المركزية، ولكن مع انخفاض في فارق الضغط بين الوريد البابي والوريد المركزي. ويرجح أن يكون ذلك ناتجاً عن انخفاض استهلاك الأكسجين في المنطقة الوريدية المركزية بسبب تنخر الخلايا الكبدية. وتظهر هذه النتائج أن منهجيتنا المتمثلة في استخدام نظام بصري لقياس الديناميكا الدموية الكبدية واستهلاك الأكسجين قادرة على توضيح آليات مختلف أمراض الكبد في الدورة الدموية الدقيقة للكبد.

يعتبر تدرج الأكسجين معاملًا أساسياً يؤثر على تعبيرات الإنزيمات في المناطق المحيطة بالوريد البابي والمناطق المركزية، وأنواع أمراض الكبد المرتبطة بالتوزيعات الدقيقة، لذا فمن المهم قياس تدفق الدم واستهلاك الأكسجين كمياً. ولتوضيح هذه الآليات، تكمن ميزة طريقتنا في أن القياس البصري المستمر وغير التلامسي يمكنه قياس تدفق الدم، وأقطار الأوعية الانفجارية، وتدرج الأكسجين في الدورة الدموية الدقيقة للكبد. تم سحب دم كامل من فأر مانح، وغُسلت كريات الدم الحمراء مرتين باستخدام PBS عن طريق الطرد المركزي عند 400 G لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، أذب 2 mg من FITC في 1 mL من DI sodium hydrogen phosphate بتركيز 100 mM، قبل ترشيح المحلول عبر غشاء مسامي بحجم 0.2 micron. بعد ذلك، ضع 1 mL من محلول FITC في أنبوب اختبار مع 0.15 mL من محلول dexterous بتركيز 3 mM، و0.25 mL من DI sodium hydrogen phosphate بتركيز 180 mM، و1.5 mL من DI sodium hydrogen phosphate بتركيز 100 mM، ثم قم بالنقر على الأنبوب للمزج. يُحفظ المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين قبل غسل كريات الدم الحمراء المصبوغة مرتين باستخدام PBS.

بعد ذلك، ضع كمية صغيرة من معلق خلايا الدم الحمراء (RBC) على شريحة زجاجية وتحقق من المظهر الطبيعي لخلايا الدم الحمراء وكفاية الفلورة؛ علّق 0.1 milliliter من خلايا الدم الحمراء في 0.9 milliliter من PBS واحفظها في درجة حرارة 4 °C حتى وقت الاستخدام. بعد ذلك، أذب 500 milligrams من BSA في 10 milliliters من PBS. ثم أضف 30 milligrams من البورفيرين بالاديوم ورجّ المزيج طوال الليل. قم بطرد المحلول مركزياً لإزالة أي بورفيرين بالاديوم غير ذائب، ثم قم بترشيح الرائق عبر غشاء مسامي بحجم 0.2 micron. صبّ 1 milliliter من الرشاحة في أنابيب اختبار واحفظها في درجة حرارة -20 °C، مع الحرص على تجنب تكرار عمليات التجميد والإذابة.

لتصوير الدورة الدموية الدقيقة مجهرياً، قم بعمل ثقب بقطر 20 millimeter في لوح بلاستيكي وقم بتغطية الثقب بغطاء زجاجي مربع يبلغ طول ضلعه 30 millimeters. قم ببسط الفص الكبدي الرئيسي على لوح بلاستيكي في وضعية الانبطاح بعد قسطرة وريد الذيل. بعد ذلك، استخدم عدة قطع من غلاف الطعام البلاستيكي بمقاس 3 millimeter في 8 millimeter لتغطية المنطقة المحيطة بالفص لمنع الحركة الناتجة عن التنفس ومنع الجفاف.

قم بمعاينة الدورة الدموية الكبدية باستخدام مجهر نافذ، وتأكد من عدم وجود ركود في تدفق الدم في مجال الرؤية لمدة 15 minutes على الأقل. ولمراقبة تدفق الدم، قم بحقن 0.2 mL من خلايا RBCs الموصومة بصبغة فلورية تدريجياً.

لقياس الضغط الجزئي للأكسجين، قم بحقن 0.2 milliliters من محلول بورفيرين البالاديوم. ستشكل كريات الدم الحمراء المسمى بـ FITC جزءًا واحدًا من 50 من إجمالي كريات الدم الحمراء التي تدور في المنطقة المرئية؛ قم بإثارة FITC عن طريق تسليط الضوء عليها باستخدام مصباح زئبقي يمر عبر مرشح تمرير نطاقي يتراوح بين 450 إلى 490 nanometer، وسجل الفلورة باستخدام كاميرا CCD. إن فسفورية بورفيرين البالاديوم ضعيفة نسبيًا وتتطلب كاشفًا عالي الحساسية وغرفة مظلمة.

توجد قمم امتصاص بورفيرين البالاديوم حول 410 و532 نانومتر، ويُوصى باستخدام الطول الموجي للتوافقي الثاني البالغ 532 نانومتر. يتم إنتاج هذا الطول الموجي بواسطة ليزر Nd:YAG النبضي؛ يتم توصيل شعاع الليزر بمجهر مقلوب وضبطه بحيث يضيء الشعاع مركز المستوى البؤري. تعتمد الدقة المكانية لليزر على حجم البقعة، والتي يمكن ضبطها عن طريق تمرير الشعاع عبر ثقب دبوسي.

قم بتثبيت مرشح تمرير طويل وأنبوب تضاعف ضوئي بالمجهر أيضاً للكشف عن الفسفرة. يجب أن يكون أنبوب التضاعف الضوئي حساساً للأطوال الموجية الحمراء، خاصة حول 700 nanometers. قم بأخذ عينات من إشارة الفسفرة وحساب ثابت الزمن للاضمحلال من خلال تطبيق دالة أسية.

في هذه التجربة، قمنا بأخذ عينات من 500 نقطة بتردد 200 kilohertz. ولغرض المعايرة، قم بتحضير محلولين من بورفيرين البالاديوم بضغط جزئي للأكسجين يبلغ 150 وصفر millimeters of mercury لكل منهما. وبالنسبة للمحلول الذي يبلغ ضغطه صفر millimeters of mercury، أضف 1% dihi sodium إلى العينات لخلق حالة ينعدم فيها الأكسجين أثناء المعايرة.

حافظ على درجة حموضة (pH) للعينة عند 7.4 ودرجة حرارة 37 درجة مئوية. ضع الفأر على منصة المجهر وقم بضبط الأوعية الدموية الدقيقة التي ترغب في تصور الدورة الدموية الدقيقة الكبدية فيها لتكون عند نقطة بقعة الليزر. يتم إعطاء الفئران وصولاً حراً إلى الماء طوال الليل، ثم يتم حقن الأسيتامينوفين بجرعة 200 مليجرام لكل كيلوجرام داخل الصفاق. بعد 24 ساعة من الحقن، يتم تخدير الفأر وكشف الكبد عن طريق إجراء شق وسطي. في حال وجود التهاب كبدي، سيكون من السهل رؤيته بالعين المجردة من خلال النخر في المنطقة المحيطة بالمركز.

أظهر قياسنا للضغط الجزئي للأكسجين والأوعية الدموية الكبدية الدقيقة في الفئران أن متوسط ضغوط الأكسجين في الأوردة البابية والجيوب الكبدية والأوردة المركزية بلغ 59.8 و48.2 و38.9 مليمتر زئبق على التوالي. بعبارة أخرى، يشير تدرج الأكسجين من المنطقة البابية إلى المركزية إلى إطلاق كافٍ للأكسجين من خلايا RBCs أثناء مرورها عبر الجيوب الكبدية. وقد قمنا بتجهيز فئران مصابة بالتهاب الكبد المستحث بواسطة الأسيتامينوفين لقياس الأوعية الدموية الكبدية الدقيقة.

كنموذج مرضي مثال، وجدنا أن الضغوط الجزئية للأكسجين في الأوردة البابية، والجيبية، والمركزية كانت أعلى في مجموعة الأسيتامينوفين مقارنة بالفئران الطبيعية. وكان فرق الضغط الجزئي للأكسجين بين الأوردة البابية والمركزية 20.9 millimeters of mercury للفئران الطبيعية و 16.9 millimeters of mercury للفئران في نموذج التهاب الكبد. وكان فرق الضغط الجزئي للأكسجين بين الأوردة البابية والمركزية 20.9 millimeters of mercury للفئران الطبيعية و 16.9 millimeters of mercury للفئران في نموذج التهاب الكبد.

ينشأ تدرج الأكسجين في الدورة الدموية الدقيقة للكبد بشكل أساسي نتيجة إمداد الأكسجين من الوريد البابي الذي تستهلكه الخلايا الكبدية، ويؤدي تنخر الخلايا الكبدية في منطقة الوريد المركزي الناتج عن الأسيتامينوفين إلى انخفاض استهلاك الأكسجين، والدورة الدموية الدقيقة في المصب، وبالتالي مشكلات تتعلق بالديناميكا الدموية. ويشارك إمداد الأكسجين واستهلاكه في العديد من أشكال أمراض الكبد. لقد قمنا بإنشاء نموذج لالتهاب الكبد الحاد ووجدنا زيادة في ضغط الأكسجين في الأوعية الدموية الدقيقة.

يمكن استخدام نظامنا البصري لاستقصاء الآليات الفسيولوجية والمرضية من خلال تحليل بنية الأوعية الدموية الدقيقة، وتوزيع التدفق، واستهلاك الأكسجين.