التصور والتحليل من تدفق الدم واستهلاك الأكسجين في دوران الأوعية الدقيقة كبدي: تطبيق نموذج لالتهاب الكبد الحاد

تم تطوير نظام بصري لتصور دوران الأوعية الدقيقة الكبدي باستخدام كريات الدم الحمراء المسماة بالفلورسنت ولقياس الضغط الجزئي للأكسجين في الأوعية الدقيقة باستخدام صور الفوسفو بمساعدة الليزر. يمكن استخدام هذه الطريقة للتحقيق في الآليات الفسيولوجية والمرضية من خلال تحليل بنية الأوعية الدموية الدقيقة وسرعة تدفق الدم والقطر وتوتر الأكسجين. في دوران الأوعية الدقيقة الكبدية ، يتدفق الدم من بوابة ES إلى E المركزي ، مما يخلق تدرجا للأكسجين بين الاثنين.

يؤثر تركيز الأكسجين في الكبد على كل من تعبير الإنزيم وعلم الأمراض الذي يقوم بتحليل تدفق الدم وقياس الأكسجين. مواضيع بحثية مهمة. تتضمن طريقتنا التجريبية إعطاء خلايا الدم الحمراء عن طريق الوريد المسمى بالفلورسنت.

من أجل تصور دوران الأوعية الدقيقة باستخدام مضان لقياس الضغط الجزئي للأكسجين ، نقوم بإعطاء بورفيرين البلاديوم عن طريق الوريد ، الذي ينبعث منه الفسفور في مجرى الدم عند إثارة الليزر بدرجة تعتمد على تركيز الأكسجين المحيط. تسمح هذه العملية بالتحليل الكمي للأكسجين ، وأظهرت قياس الضغط الجزئي لدوران الأوعية الدقيقة الكبدية الضغط الجزئي للأكسجين الوريدي البابي والمركزي يبلغ 59.8 و 38.9 ملم من الزئبق على التوالي مما يدل على القياس الفعال لتركيز الأكسجين. بعد ذلك ، طبقنا هذه المنهجية على نموذج التهاب الكبد.

وجدنا ارتفاعا في الضغط الجزئي للأكسجين في البوابة ES الجيبية والمركزية ، ولكن انخفاض فرق الضغط بين البوابة والمركزية. من المحتمل أن يكون هذا بسبب انخفاض استهلاك الأكسجين في منطقة Ven المركزية بسبب نخر خلايا الكبد. تظهر هذه النتائج أن منهجيتنا في استخدام نظام بصري لقياس ديناميكا الدم الكبدية واستهلاك الأكسجين قادرة على توضيح آليات أمراض الكبد المختلفة في الدورة الدموية الدقيقة الكبدية.

تدرج الأكسجين هو معلمة أساسية تتضمن تعبيرات عن الإنزيمات في المناطق المحيطة بالجوابة والمناطق شبه المركزية ، وأنواع الأمراض الكبدية المتعلقة بالتوزيعات الدقيقة ، لذلك من المهم تحديد تدفق الدم واستهلاك الأكسجين. لتوضيح الآليات ، فإن ميزة طريقتنا هي عدم الاتصال والقياس البصري المستمر يمكن أن يحدد تدفق الدم وأقطار الأوعية الانفجارية وتدرج الأكسجين في الدورة الدموية الدقيقة الكبدية. تم سحب الدم الكامل من فأر متبرع وغسل كريات الدم الحمراء مرتين باستخدام PBS عن طريق الطرد المركزي عند 400 جم لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بإذابة ملليغرامين من FITC في مليلتر واحد ، 100 ملليمولار من فوسفات هيدروجين الصوديوم DI قبل الترشيح من خلال غشاء مسام 0.2 ميكرون. بعد ذلك ، ضع محلول FITC سعة مليلتر واحد في أنبوب اختبار مع محلول ماهر سعة 0.15 مليلتر من ثلاثة ملليمولار ، وفوسفات هيدروجين الصوديوم DI سعة 0.25 مليلتر 180 ملليمولار DI ، و 1.5 مليلتر 100 ملليمولار DI فوسفات هيدروجين الصوديوم واضغط للخلط. احتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين قبل غسل كرات الدم الحمراء الملطخة مرتين باستخدام PBS.

بعد ذلك ، ضع كمية صغيرة من تعليق كرات الدم الحمراء على شريحة زجاجية وتأكد من المظهر الطبيعي لكرات الدم الحمراء وتعليق 0.1 ملليلتر من كرات الدم الحمراء في 0.9 مليلتر من PBS واحتفظ بها أربع درجات مئوية حتى الاستخدام التالي ، قم بإذابة 500 ملليغرام من BSA في 10 ملليلتر من PBS. ثم أضف 30 ملليغرام من بورفيرين البلاديوم وقم بتحريك أجهزة الطرد المركزي طوال الليل ، وهو الحل لإزالة أي بورفيرين البلاديوم غير القابل للحل وتصفية SUP natin من خلال غشاء بو 0.2 ميكرون بليغ ، مليلتر واحد من الترشيح في أنابيب الاختبار وتخزينه عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. الحرص على تجنب التجميد والذوبان المتكرر.

لتصور دوران الأوعية الدقيقة مجهريا ، قم بقطع ثقب قطره 20 ملم في صفيحة بلاستيكية وقم بتغطية الفتحة بغطاء زجاجي مربع 30 ملم على الجانب. انشر الفص الكبدي الرئيسي على صفيحة بلاستيكية في وضع الانبطاح بعد قنية وريد الذيل. بعد ذلك ، استخدم أقساما متعددة بحجم ثلاثة ملليمترات × ثمانية ملليمترات من غلاف الطعام البلاستيكي لتغطية المنطقة المحيطة بالفص لمنع الحركة من التنفس والتجفيف.

تصور الدورة الدموية الكبدية باستخدام مجهر الإرسال وتأكد من عدم وجود ركود في تدفق الدم في مجال الرؤية لمدة 15 دقيقة على الأقل. لمراقبة تدفق الدم حقن تدريجيا. أشر ملليلترين من كرات الدم الحمراء المسمى بالفلورسنت.

لقياس الضغط الجزئي للأكسجين ، قم بحقن 0.2 مل من محلول البلاديوم بورفيرين. ستمثل كرات الدم الحمراء المسماة FITC واحدا من 50 من جميع كرات الدم الحمراء المتداولة في المنطقة المرئية ، وتثير FITC عن طريق تشعيعها بمصباح زئبق يمر عبر مرشح تمرير نطاق 450 إلى 490 نانومتر وتسجيل التألق بكاميرا CCD. فسفور البلاديوم البورفيرين ضعيف نسبيا ويتطلب كاشفا عالي الحساسية وغرفة مظلمة.

قمم امتصاص البلاديوم بورفيرين حوالي 410 و 532 نانومتر ، ويوصى بالطول الموجي التوافقي الثاني البالغ 532 نانومتر. يتم إنتاج هذا الطول الموجي بواسطة ليزر نبضي YAG من النيوديميوم ، ويقوم بتوصيل شعاع الليزر بمجهر مقلوب وضبطه بحيث يضيء الشعاع مركز المستوى البؤري. تعتمد الدقة المكانية لليزر على حجم البقعة ، والذي يمكن تعديله عن طريق تمرير الشعاع عبر ثقب.

قم بتوصيل مرشح طويل التمرير وأنبوب مضاعف ضوئي بالمجهر أيضا للكشف عن الفسفر. يجب أن يكون PMT حساسا للأطوال الموجية الحمراء ، خاصة حوالي 700 نانومتر. أخذ عينة من الإشارة الفسفورية واحسب ثابت وقت الاضمحلال من خلال تطبيق دالة أسية.

في هذه التجربة، أخذنا عينات من 500 نقطة عند 200 كيلو هرتز. للمعايرة ، قم بإعداد محلولين من بورفيرين البلاديوم بضغط جزئي للأكسجين يبلغ 150 وصفر ملليمتر من الزئبق لكل منهما. بالنسبة للصفر ملليمترات من محلول الزئبق ، أضف 1٪ ثنائي الصوديوم إلى العينات لتهيئة الحالة التي يكون فيها الأكسجين غائبا أثناء المعايرة.

حافظ على درجة حموضة العينة 7.4 ودرجة حرارة 37 درجة مئوية. ضع الماوس على مرحلة المجهر واضبط الأوعية الدقيقة التي تريد تصور دوران الأوعية الدقيقة الكبدية من أجلها إلى نقطة الفئران السريعة بالليزر مع حرية الوصول إلى الماء بين عشية وضحاها ، وحقن الأسيتامينوفين بمعدل 200 ملليغرام لكل كيلوغرام داخل الصفاق بعد 24 ساعة من الحقن ، وتخدير الفأر وفضح الكبد بشق متوسط. إذا كان هناك التهاب كبد ، فسيكون مرئيا بسهولة بالعين المجردة من خلال النخر في المنطقة شبه المركزية.

أظهر قياسنا لضغط الأكسجين الجزئي والأوعية الدقيقة الكبدية في الفئران متوسط ضغط الأكسجين للبوابات وتربة الجيوب الأنفية والشقيق المركزية 59.8 و 48.2 و 38.9 ملم من الزئبق على التوالي. بمعنى آخر ، يشير تدرج الأكسجين من البوابة إلى المحطة الكهرومغناطيسية المركزية إلى إطلاق كمية كافية من الأكسجين من كرات الدم الحمراء أثناء مرورها عبر الجيوب الأنفية. قمنا بإعداد الفئران الناجمة عن التهاب الكبد الناجم عن الأسيتامينوفين لقياس الأوعية الدقيقة الكبدية.

كمثال على نموذج علم الأمراض ، وجدنا أن الضغوط الجزئية للأكسجين في الأزياء البابية والجيوب الأنفية والمركزية كانت أعلى في مجموعة الأسيتامينوفين مقارنة بالفئران العادية. كان فرق الضغط الجزئي للأكسجين بين الأغذية البابية والشفقة المركزية 20.9 ملم من الزئبق للفئران العادية و 16.9 ملم من الزئبق للفئران النموذجية لالتهاب الكبد. كان فرق الضغط الجزئي للأكسجين بين الأغذية البابية والشفقة المركزية 20.9 ملم من الزئبق للفئران العادية و 16.9 ملم من الزئبق للفئران النموذجية لالتهاب الكبد.

ينشأ تدرج الأكسجين في دوران الأوعية الدقيقة الكبدي بشكل أساسي بسبب إمداد الأكسجين من البوابة التي تستهلكها خلايا الكبد ، ونخر خلايا الكبد في المنطقة الوريدية المركزية الناجم عن الأسيتامينوفين يؤدي إلى انخفاض استهلاك الأكسجين ، ودوران الأوعية الدقيقة في اتجاه مجرى النهر ، وبالتالي المشكلات المتعلقة بديناميكا الدم. يشارك إمداد الأكسجين واستهلاك الأكسجين في العديد من أشكال أمراض الكبد. قمنا بعمل نموذج التهاب الكبد الحاد ووجدنا زيادة في توتر الأكسجين في الأوعية الدقيقة.

يمكن استخدام نظامنا البصري للتحقيق في الآليات الفسيولوجية والمرضية من خلال تحليل بنية الأوعية الدموية الدقيقة ، بدلا من توزيع التدفق واستهلاك الأكسجين.