وα الاختبار: رابيد تعداد CD4 خالية من الخلايا عن طريق اللعاب الجامعة

هناك حاجة ملحة لتوفير طريقة منخفضة التكلفة لتعداد خلايا CD4 لمراقبة مرض HIV في المناطق محدودة الموارد. يوضح هذا الفيديو اختباراً منخفض التكلفة للفحص في نقطة الرعاية، حيث يتم تحديد تعداد خلايا CD4 بناءً على وجود مثبط البروتياز Alpha one PI في اللعاب. وللقيام بذلك، يُعطى الشخص أو المريض أولاً قطعة حلوى بنكهة الليمون لتحفيز إفراز السائل المصلِي في اللعاب.

يتم جمع اللعاب في كوب عينات ونقله إلى لوحة مقايسة ذات 96 بئراً. ثم تُضاف كمية مشبعة من البروتيناز porcine pancreatic elastase إلى اللعاب حيث يرتبط بـ alpha one pi ويثبطه. بعد ذلك، تضاف مادة الركيزة اللونية لإنزيم elastase.

يعمل أي إنزيم إيلاستاز متبقٍ غير مرتبط على شطر المادة الخاضعة للتفاعل، مما يؤدي إلى تغير اللون من الشفاف إلى الأصفر. يُضاف صبغ كوماسي بلو (Kumasi blue) إلى الآبار لصبغ البروتين الكلي، وتؤخذ قياسات قياس الألوان باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة. وفي النهاية، يتم تحديد نسبة alpha one PI إلى البروتين الكلي واستخدامها لتقييم تعدادات CD four بدقة بناءً على قيمة مؤشرية.

هناك عدة مزايا لهذه التقنية مقارنة بالطريقة الحالية، وهي قياس التدفق الخلوي. إذ يمكن إجراء هذا الاختبار ميدانياً دون الحاجة إلى سحب الدم، وهو إجراء مجهد ومكلف، ودون استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة الباهظة الثمن، ودون الحاجة إلى تدريب تقني أو تبريد أو نقل للعينات. وتتجاوز هذه الطريقة حاجزاً حرجاً أمام التدخل لمكافحة مرض الإيدز، ومن شأنها أن تؤثر بشكل كبير على التكلفة والنتائج الصحية للمرضى ومعدل انتقال فيروس HIV، وهي عوامل تؤثر جميعها بشكل كبير على الاقتصاد العالمي.

يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية حول كيفية تنظيم Alpha و PI لعدد خلايا CD four T من خلال الالتصاق والهجرة، ولكن يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل كيفية تنظيم مثبطات البروتينات الأخرى لالتصاق وهجرة أنواع أخرى من الخلايا. لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما اكتشفنا أن Alpha one PI كان منخفضاً جداً لدى المرضى المصابين بـ HIV، لدرجة أنه يحد فعلياً من عدد خلايا CD four T التي تصل إلى الدم. ابدأ هذا البروتوكول بتحضير المحاليل العاملة المطلوبة لكل لوحة مجهرية سيتم استخدامها.

حضّر 60 milliliters من محلول التريس الملحى المنظم (TBS) بتركيز 0.05 molar وبدرجة pH تبلغ 7.8. كما يجب تحضير ستة milliliters من إنزيم الإيلاستاز البنكرياسي الخنزيري من النوع الأول (PPE) لكل لوحة معايرة دقيقة. رجّ مُعلق PPE جيداً، ثم خففه في محلول TBS ليصل إلى تركيز 0.01 units per milliliter تقريباً.

بعد ذلك، قم بتحضير محلول مخزون بتركيز 0.1 مولار من الركيزة اللونية SA three NA في DMSO؛ يجب استخدام هذا المحلول المخزون على الفور أو تخزينه عند درجة حرارة -20 °C إذا كان سيُستخدم لاحقاً. قم بتحضير ستة ملليلترات من محلول العمل لكل صفيحة مجهرية عن طريق تخفيفه بنسبة 1 إلى 100 في TBS. وأخيراً، قم بتحضير محلول مخزون بتركيز 10% من kumasi brilliant blue R two 50 في TBS واستخدمه على الفور أو خزنه عند درجة حرارة -20 °C إذا كان سيُستخدم لاحقاً.

قم بتحضير ستة ملليلترات لكل لوحة ميكروية عن طريق تخفيف المخزون بنسبة 1 إلى 1000 في TBS. عند التعامل مع اللعاب، من المهم اتخاذ الاحتياطات المناسبة مثل ارتداء القفازات ومعطف المختبر مع جعل الشخص الخاضع للبحث أو المريض في وضعية الوقوف. ضع SGO في الفم لتحفيز نضح المصل.

يقوم مساعد باحث بدور مريض HIV في هذا العرض التوضيحي. وتعد حبة ليمون خالية من السكر خياراً ملائماً لمرضى HIV الذين غالباً ما يكونون فاقدين للأسنان وغير قادرين على مضغ العلكة؛ ابتلع الحبة حسب الحاجة في الدقائق الثلاث الأولى، ثم اجمع لعاب الفم بالكامل في كوب عينات خلال الدقائق الثلاث التالية. سيوفر ذلك حوالي 2 mL من اللعاب.

إذا لم يتم استخدام اللعاب فوراً، فيجب تجميده وتخزينه عند درجة حرارة -80 °C، وفي يوم معالجة العينة يتم تدفئتها عند درجة حرارة 37 °C. وبمجرد إذابته، يمكن تخزين اللعاب في درجة حرارة من 2 إلى 4 °C لمدة تصل إلى ثلاثة أيام. يتم توزيع كل عينة وعينة ضابطة في ثلاث مكررات في طبق مسطح القاع يحتوي على 96 بئراً لإعداد المقايسة، وذلك بإضافة 130 µL من TBS إلى كل بئر من آبار العينات وآبار الضوابط.

ثم يتم تجنب الميوسين، وهو مادة لزجة ولا تحتوي على نضحة مصلية. يتم نقل 20 µL من اللعاب إلى كل من ثلاثة آبار اختبار وثلاثة آبار ضابطة سالبة. ثم تُضاف 20 µL من TBS إلى الآبار الضابطة الموجبة مع الخلط عن طريق الماصة.

في هذه الخطوة، من المهم تجنب استخدام جهاز مزج العينات (vortex) لمنع تكون فقاعات أثناء سحب اللعاب بالماصة، وتجنب سحب الجسيمات الصلب والمخاط. بعد ذلك، رُجّ محلول العمل الخاص بـ pancreatic elastase أو PPE جيداً لخلطه، ثم أضف 50 µL منه إلى آبار العينات وآبار الضابط الموجب وآبار الضابط السالب.

أضف 50 µL من TBS. لا داعي للخلط لأن الحجم المضاف كبير بما يكفي للسماح بتوزيع متساوٍ داخل خليط اللعاب. احضن الطبق لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد انتهاء فترة الحضن، أضف 50 µL من المحلول العامل لركيزة الإيلاستاز SA three NA إلى كل بئر، ثم احضن العينات لمدة 45 دقيقة إضافية عند درجة حرارة 23 °C. وبعد مرور 45 دقيقة، أضف 50 µL من محلول Coomassie blue العامل إلى كل بئر.

بعد ذلك، اقرأ الامتصاصية باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة عند 405 نانومتر للكشف عن انشطار SA three NA، وعند 595 نانومتر للكشف عن صبغة kumasi blue، والتي تمثل محتوى البروتين الكلي. ولحساب مؤشر alpha one PI، استخدم أولاً الصيغة التالية للحصول على الامتصاصية المُطبعة لكل طول موجي، وذلك بقسمة الفرق بين متوسط العينة ومتوسط الضابط السلبي على الفرق بين متوسط الضابط الإيجابي ومتوسط الضابط السلبي. ثم للحصول على مؤشر alpha one PI، اقسم الامتصاصية المُطبعة عند 405 نانومتر على الامتصاصية المُطبعة عند 595 نانومتر كما هو موضح هنا، وذلك لتحديد ما إذا كان اختبار alpha قد يكون مناسباً للاستخدام كاختبار مسحي في نقاط الرعاية لمراقبة تعدادات CD four في المناطق الموبوءة ومحدودة الموارد.

تم جمع لعاب مُحفز من 20 أنثى و11 ذكراً من المصابين بفيروس HIV-1 المترددين على عيادة للرعاية الروتينية في الكاميرون، وبما يتفق مع الملاحظات الأولية أثناء تطوير الاختبار ألفا باستخدام لعاب جُمع من مدينة نيويورك، فقد ارتبط مؤشر alpha one PI واللعاب الذي جُمع من الكاميرون بتعدادات CD4 بقيمة R squared بلغت 0.91 وقيمة P أقل من 0.0001. وقد تم تحديد هذه العلاقة بواسطة منحنى سيجمويدي ثلاثي المعاملات، وهو ما يتفق مع علاقة الاستجابة للجرعة. كما تظهر فترات الثقة والتنبؤ بنسبة 95% بالخطين الأزرق والأحمر على التوالي.

في دراسة سابقة، حددنا أن الخلايا التائية الموجبة لـ CD4 تظهر دورة جيبية بدورية تبلغ 23 ± 3.5 يومًا لدى المصابين بفيروس HIV-1 ولدى الأشخاص الذين يعانون من النسخة الموروثة من نقص alpha 1 PI من النمط PIZZ. يمثل الشكل الموضح هنا مثالاً نموذجياً لتحليل منحنى الجيب المولد حاسوبياً لدورة CD4 في مجموعة ضابطة صحية غير مصابة بفيروس HIV، والتي تظهر دورية مدتها 27 يومًا. وقد أسفر تحليل منحنى الجيب المولد حاسوبياً للتغيرات في الخلايا التائية الموجبة لـ CD4 لدى ستة أشخاص عن قيم لسعة الذروة إلى الذروة ومحور التذبذب وفقاً للتوقعات. وكان محور التذبذب مرتبطاً بالسعة بقيمة R-squared بلغت 0.96 وقيمة p بلغت 0.009.

في المرضى الذين لديهم تعداد منخفض من الخلايا التائية CD4 الموجبة، كانت التغيرات الدورية في تعداد الخلايا التائية CD4 صغيرة، بينما كانت التغيرات الدورية كبيرة في المرضى الذين لديهم تعداد مرتفع من الخلايا التائية CD4 الموجبة، وذلك لأن خط الانحدار الموضح هنا يقدر محور التذبذب، ومحور التذبذب يرتبط بالسعة. يمكن حساب السعة لخط الانحدار لتقدير مدى التباين المتوقع للخلايا التائية CD4 الموجبة فوق وتحت خط الانحدار نتيجة التذبذب الدوري؛ وبدمج السعة المحسوبة مع فاصل الثقة، وُجد أن السعة التي يشير إليها الخط الأخضر تقع ضمن فاصل الثقة 95% الذي يشير إليه الخط الأزرق.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إجراؤها في غضون 90 دقيقة بدءاً من وقت جمع اللعاب وحتى الحصول على عدد خلايا CD four للمريض. يُقصد استخدام هذا الإجراء كاختبار مسحي لمراقبة تعدادات CD four. وإذا أظهر المريض تغيرات جوهرية في تعدادات CD four، فيجب حينئذٍ متابعة حالة المريض باستخدام قياس التدفق الخلوي (flow cytometry) للتأكد من صحة قياسات تعدادات CD four وللمساعدة في اتخاذ قرارات العلاج.

في المرحلة التالية من التطوير، سيتم تحويل مقايسة اللوح الدقيق (Microplate assay) إلى تقنية الشريط الغمس (dipstick technology)، مما سيتيح إجراء الاختبارات دون الحاجة إلى جهاز أو كهرباء. من غير المرجح أن ينتقل فيروس HIV عن طريق اللعاب، ولكن غالباً ما يعاني مرضى HIV من أمراض معدية أخرى مثل السل والتهاب الكبد C، لذا يجب تذكر أن التعامل مع اللعاب، تماماً مثل التعامل مع الدم، قد يكون خطيراً للغاية بسبب الجسيمات المعدية المجهولة. يجب اتخاذ الاحتياطات دائماً، مثل ارتداء القفازات ومعدات الوقاية الشخصية الأخرى أثناء تنفيذ هذا الإجراء.