إلى الوراء تحميل من الأعصاب، ومساحات، وجذور العمود الفقري مع الأصباغ الفلورية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إدخال تركيز عالٍ من صبغة فلورية أو صبغة حساسة للأيونات في العصبونات أو أي مسار عصبي باستخدام تقنية بسيطة ومنخفضة التكلفة. يتم تحقيق ذلك من خلال تصنيع نوعين من الماصات أولاً، النوع الأول والنوع الثاني. بعد ذلك، يتم توصيل أنبوب مطاطي مرن بالماصة من النوع الأول وتطبيق ضغط إيجابي لسحب المسار العصبي المستهدف إلى داخل الماصة من النوع الأول، مع التحقق من إتمام عملية الختم بإحكام.

بعد ذلك، أدخل الماصة من النوع الثاني في الماصة من النوع الأول واستخدم الماصة من النوع الثاني لسحب ما تبقى من A CSF من الماصة من النوع الأول. ثم أضف الصبغة إلى الماصة من النوع الأول مع مراعاة عدم إدخال فقاعات هوائية. وتتمثل الخطوة النهائية في تحضين العصبونات في الظلام لمدة تتراوح بين 6 إلى 20 ساعة.

وفي النهاية، بعد إزالة الماصة من النوع الأول، يصبح التحضير جاهزاً للدراسات المختبرية، أو الفيزيولوجية الكهربائية، أو المورفولوجية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التطبيق في الحمام، وحقن BOS، والتثقيب الكهربائي، في أن الـ D يتم توصيله إلى مجموعة عصبية محددة. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال العلوم العصبية، مثل النشاط، والترابط، والمورفولوجيا، وتوزيع عصبونات محددة.

بشكل عام، تتطلب هذه التقنية التدريب، لا سيما لضمان عدم تخفيف الصبغة داخل الماصة من النوع الأول وعدم دخول فقاعات هواء إليها. ابدأ هذا الإجراء بسحب أنبوب البولي إيثيلين فوق لهب مصباح كحولي لإنتاج ماصتين قصيرتين بنهايات مستدقة. أولاً، اسحب ماصة قصيرة من النوع الأول ذات طرف صغير يمكنه الإمساك بالجذر أو المسار المستهدف بإحكام.

بعد ذلك، اسحب ماصة من النوع الثاني ذات عمود أطول وأكثر نحافة وطرف دقيق جداً يمكن إدخاله في ماصة النوع الأول وصولاً إلى طرفها. بعد ذلك، قم بتوصيل ماصة النوع الثاني بإبرة قياس 19 مثبتة بـ EC. ثم ضع النخاع الشوكي المعزول في حمام.

قم بدمجه مع سائل CSF مبرد طوال عملية التحميل. بعد ذلك، ضع الماصة من النوع الأول على حامل قطب كهربائي بحيث يمكن توصيل فتحتها الخلفية بسهولة بمحقنة عبر أنبوب مرن. في هذا الإجراء، اسحب أولاً سائل CSF إلى الماصة من النوع الأول باستخدام محقنة.

بعد ذلك، قم برسم المسلك المحوري أو الجذر المراد ملؤه. ثم قم بإزالة الأنبوب المرن من الفتحة الخلفية. بعد ذلك، قم بتوصيل الماصة من النوع الثاني بمحقنة أخرى.

أدخلها في الماصة من النوع الأول، التي تثبت مساراً محورياً أو جذراً عصبياً تحت المجهر. استخدم المحقنة المتصلة بالماصة من النوع الثاني لسحب الـ A CSF بحيث يغطي الـ A CSF المتبقي المسار المحوري فقط. ثم اسحب الماصة من النوع الثاني من الماصة من النوع الأول.

راقب مستوى الـ A CSF لبضع دقائق للتأكد من إحكام السد على المسار المحوري أو الأعصاب. بعد ذلك، قم بإذابة الصبغة في A CSF أو 0.2% Triton X 100 في ماء مقطر مزدوج. اسحب المحلول إلى الماصة من النوع الثاني عن طريق تطبيق ضغط سلبي خفيف على المحقنة المتصلة، مع الحرص على عدم سحب أي فقاعات هوائية.

بعد ذلك، أدخل الماصة من النوع الثاني التي تحتوي على الصبغة في محلول A CSF المتبقي. وفي الماصة من النوع الأول، حرر الصبغة ببطء في A CSF باستخدام ضغط إيجابي خفيف عبر المحقنة. تأكد من عدم إدخال أي فقاعات هوائية أو التسبب في إزاحة النسيج المستهدف من داخل الطرف. إذا تسللت فقاعة هوائية إلى الماصة من النوع الأول أثناء حقن الصبغة، فقم بسحب الفقاعة عن طريق دفع طرف الماصة من النوع الثاني بالقرب من الفقاعة، ثم تطبيق ضغط سلبي ضعيف بلطف باستخدام المحقنة المتصلة.

بعد تحرر كمية كافية من الصبغة، اسحب ماصة النوع الثاني. بعد ذلك، قم بحضن النسيج في الظلام لمدة تتراوح من 6 إلى 20 ساعة، وذلك حسب نوع التجربة. وبمجرد انقضاء الوقت الكافي لعملية الملء، اسحب القطب الكهربائي برفق بعيداً عن النسيج.

بعد ذلك، تصبح الأنسجة جاهزة للتصوير أو الفحص النسيجي. يوضح المخطط التوضيحي التالي عملية تحميل ثلاثة صبغات فلورية مختلفة مقترنة بالديكستران في آن واحد في العصبونات الحركية، والألياف الحسية الواردة، والعصبونات البينية الشوكية؛ حيث تم ملء العصبونات الحركية والألياف الحسية العجزية الواردة عكسياً باستخدام Cascade blue Dextran و Texas red dextran عبر الجذور البطنية والظهرية على التوالي. بينما تم تحميل Green fluorescent dextran في العصبونات البينية الشوكية التي تصعد محاويرها عبر الحبل البطني.

تظهر هنا صورة مجهرية بؤرية (confocal) لمقطع من النخاع الشوكي العجزي حيث تم وسم العصبونات تراجعيًا. لاحظ أن الألياف الحسية الواردة الموسومة هي في الغالب في نفس الجانب (ipsilateral). ومع وجود عدد قليل من الإسقاطات في الجانب المقابل، تكون العصبونات الحركية الموسومة في نفس جانب الجذر البطني المملوء، بينما تكون العصبونات البينية الموسومة في الجانب المقابل له كما يشير رأس السهم.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق إضافية للإجابة على أسئلة رئيسية مثل الاتصالية الوظيفية، والتوازن بين الاستثارة والتثبيط، ونوع الجيوب، والتوزيع، وإنتاج النواقل العصبية في عصبونات حقل DI. لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفسيولوجيا العصبية للنخاع الشوكي وجذع الدماغ لتمييز مجموعات عصبونية محددة باستخدام الأصباغ الحساسة للأيونات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق الأصباغ الفلورية و/أو الأصباغ الحساسة للأيونات في العصبونات والألياف الحسية في النخاع الشوكي المعزول.