Name: إلى الوراء تحميل من الأعصاب، ومساحات، وجذور العمود الفقري مع الأصباغ الفلورية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: تعلم تقنية تحميل الأصباغ الفلورية والحساسة للكالسيوم في الخلايا العصبية باستخدام ماصة البولي إيثيلين. هذه الطريقة البسيطة والمنخفضة التكلفة تُمكّن الباحثين من دراسة نشاط واتصال الخلايا العصبية بدقة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من خلال البرنامج الداخلي للمعاهد الوطنية للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية في المعاهد الوطنية للصحة. كما نود أن نشكر الدكتور George Mentis على مساهماته السابقة في الطريقة وفي البيانات الواردة في الشكل 3.

وقد استخدمت dextrans فلوري كأدوات التشريحية وللتصوير نشاط الخلايا العصبية 1-4. الحقول وآخرون، (2009) 4 نشر بروتوكول لتطبيق ايون والجهد حساسة للأصباغ إلى مساحات محواري مع التركيز على الحبل الشوكي ونظام نموذجي. نحن هنا وصفا لإجراءات أكثر تفصيلا لتطبيق صبغة الفلورسنت و / أو أيون الحساسة إلى الجذور بطني قطع والجذور الظهرية أو أي المسالك العصبية في النخاع الشوكي لفي المختبر دراسات optophysiological والمورفولوجية. 1. النوع الأول والنوع الثاني الماصات تبدأ سحب قسمين قصيرة من أنابيب البولي ايثيلين (PE90، العلامة التجارية ادامز كلاي) على شعلة مصباح الكحول 7 إلى إنتاج الماصات مع نصائح مدبب. ينبغي للمرء أن ماصة (نوع-I) أن تكون قصيرة (3-7 ملم) مع طرف الصغيرة التي يمكن أن تعقد بإحكام جذر هدف أو المسالك (القطر الخارجي: 0،2-0،4 مم؛ القطر الداخلي: 0،1-0،3 مم). ثم سحب ماصة الثاني (نوع-II) مع أطول (8-12 سم) رمح أرق، وطرف ناعم جدا (القطر الخارجي: 0،2-0،3 مم؛ القطر الداخلي: 0،1-0،2 مم) التي يمكن إدراجها في نوع-I ماصة بقدر على الحافة. سيتم استخدام ماصة أرق الثانية لنضح وإدخال الاصطناعي السائل النخاعي (aCSF) والحل صبغ على التوالي من نوع ماصة-I. 2. تحديد المواقع من نوع-I ماصة تشريح وعزل النخاع الشوكي 8،9 ووضعه في حمام، superfused مع aCSF مبرد (~ 16 درجة مئوية) في جميع مراحل عملية التحميل. وضع نوع-I ماصة على حامل قطب كهربائي (H1/12 حامل قطب كهربائي، Narishige) بحيث يمكن افتتاحه ظهر صلها بسهولة إلى حقنة (1ml U-100 حقنة الأنسولين، بيكتون ديكنسون أو مشابه) عن طريق أنابيب مرنة (PharMed BPT، كول، Parmer، # AY242002؛ 10 سم) (Fig.1A-B). 3. صبغ التطبيق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام محقنة، رسم 1تليها القناة محواري أو جذر المراد شغلها (الشكل 2B)؛ aCSF في ماصة نوع-I (2A Fig.1B). وينبغي بعد ذلك في أنابيب مرنة يمكن ازالتها من الافتتاح الى الوراء. يتم إرفاق ماصة من النوع الثاني إلى آخر حقنة وإدخالها في النوع الأول عقد ماصة المسالك محواري أو جذر. استخدام الحقنة التي تعلق على ماصة النوع الثاني، نضح aCSF بحيث aCSF المتبقي يغطي فقط الجهاز محواري (Fig.1C؛ 2C-D). ثم سحب ماصة النوع الثاني من نوع ماصة-I. مراقبة مستوى aCSF لبضع دقائق للتحقق من ختم جيدة على المسالك محواري أو الأعصاب (انظر القسم 3 في حل لمشاكل تخص &quot;ختم جيدة&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل الصبغة في aCSF أو 0.2٪ تريتون X-100 في الماء المقطر المزدوج واستدراجه الى ماصة من النوع الثاني في حين لا تولي اهتماما لتشمل فقاعات الهواء. إدراج ماصة النوع الثاني يحتوي على صبغ في ماصة من النوع الأول وإلى حل aCSF المتبقية (الشكل 2E). الافراج عن ببطءالصبغة في aCSF باستخدام ضغط إيجابي لطيف (الشكل 2F). يجب الحرص على عدم إدخال أي فقاعات هواء أو التسبب في نزوح النسيج المستهدف من داخل الحافة. سحب ماصة النوع الثاني بعد كمية كافية من صبغ لقد تم الافراج عن (3-5 ميكرولتر من محلول الصبغة). </li></ol> 4. حضانة احتضان النسيج في الظلام ما بين 6 إلى 20 ساعة اعتمادا على نوع من التجربة. مرة واحدة ولم يسمح الوقت الكافي للتعبئة، وسحب بلطف بعيدا القطب من النسيج تاركا الأنسجة جاهزة للتصوير أو الأنسجة. استكشاف الأخطاء وإصلاحها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان النسيج المستهدف لا يدخل بسهولة الى غيض من ماصة نوع من أنا أو هو فضفاض داخل مرة واحدة، ثم قطر طرف هو حجم الخطأ. إذا حدث هذا، سحب واستخدام ماصة مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل إضافة إلى صبغ aCSF في ماصة النوع الأول، تأكد من أنه لا يزال aCSF بما فيه الكفاية بحيث يمكن التوصل إليه معالنوع الثاني ماصة طرف (الشكل 2D). وإلا فإن وجود فجوة في الهواء مرة واحدة يضاف صبغ. إذا حدث هذا، لا تضيف الصبغة وإزالة الجهاز محواري من ماصة ثم استدراجه إلى الخلف في aCSF مع ما يكفي من التوصل إلى نوع من ماصة-II. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان مستوى aCSF في الزيادات ماصة نوع من أنا بعد أن يستنشق ذلك مع ماصة من النوع الثاني، وهو ما يعني أن الختم مع النسيج ليست جيدة. استخدام القطب مختلفة، وإلا سيتم تخفيف الصبغة أثناء إجراء وضع العلامات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم إدخال أية فقاعة الهواء إلى ماصة نوع-I في حين حقن الصبغة، واستنزاف خارج الفقاعة من خلال دفع غيض ماصة النوع الثاني على مقربة من فقاعة وتطبيق بلطف ضغط سلبي ضعيف باستخدام محقنة المرفقة. </li></ol> 5. ممثل النتائج لتوضيح تطبيق طريقة، ونحن تحميلها في وقت واحد العصبونات الحركية، الحسية وafferents interneurons الشوكي مع ثلاثة dext مختلفةركض، مترافق الأصباغ الفلورية (الشكل 3A). كما هو موضح في الشكل. وصفت 3B وثلاثة أنواع من الخلايا العصبية، الحسية afferents (الحمراء)، interneurons إسقاط في الحبلة بطني (الخضراء) والعصبونات الحركية (الأزرق). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig1.jpg" /> الشكل 1. تخطيطي يظهر الماصة من النوع الأول ونوع التجمع الثاني. (أ) من النوع الأول يتم وضع ماصة (الضوء الأزرق) على حامل قطب كهربائي حتى أنه ظهر ويمكن فتح صلها بسهولة إلى الأنبوب الاستومر مرنة (B) والذي يمكن أن يتم إدخال ماصة من النوع الثاني (C). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig2.jpg" /> الشكل 2. تخطيطي يظهر عملية التحميل من العصبونات الحركية مع الأصباغ الفلورية. (أ) يتم وضع ماصة نوع-I بالقرب من جذر بطني المراد ملؤها. (ب) يطبق شفط للماصة لرسم aCSF في ماصة تليها جذورها. (C-D) افصل أنابيب مرنة من المطاط الصناعي الخلفية من نوع-I ماصة وتقليل كمية aCSF من خلال تطبيق الشفط إلى ماصة من النوع الثاني. (ه) إدراج غيض من ماصة النوع الثاني يحتوي على صبغ المذابة إلى aCSF المتبقية في ماصة نوع-I. (EF) ملء ببطء ماصة نوع-I مع الصبغة ومن ثم إزالة ماصة من النوع الثاني. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig3.jpg" /> الشكل 3. تطبيق إجراء تعبئة إلى الحبل الشوكي الماوس معزولة. (أ) تخطيطي يظهر ثلاثة أنواع من أنا الماصات المستخدمة لملء الطبقات المختلفة في الخلايا العصبية في النخاع الشوكي. تم ردم من خلال الجذور البطنية والظهرية، على التوالي العصبونات الحركية (الأزرق؛؛ تتالي ديكستران الأزرق) وafferents الحسية عجزي (تكساس الأحمر ديكستران الحمراء). وقد استخدم فلوريسئين ديكستران لتحميل interneurons الشوكي (الخضراء) التي تصعد من خلال محاور عصبية الحبلة بطني (VF). 1 ملغ من كل صبغة ديكستران (10،000 ميغاواط، المسابر الجزيئية)تم حله في 6 الماء المقطر ميكروليتر التي تحتوي على 0.2٪ تريتون X-100 (B). مبائر صورة لمقطع من الحبل عجزية من الحبل الشوكي في الخلايا العصبية التي عادت المسمى كما هو موضح في الملاحظة أ أن afferents المسمى الحسية هي في المقام الأول المماثل مع التوقعات 1 المقابل قليلة. والعصبونات الحركية وصفت هي المماثل إلى الجذر بطني مليئة بينما interneurons صفت هي المقابل إلى جانب التعبئة (رأس السهم). شريط معايرة 200 ميكرومتر.

<ol><li>Nance, D. M., Burns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextrans+as+sensitive+anterograde+neuroanatomical+tracers%3A+applications+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls.</a> Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).</li>
<li>Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextran-amines+used+as+axonal+tracers+in+the+nervous+system+of+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo.</a> J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).</li>
<li>McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+neuronal+activity+in+tissue+labeled+by+retrograde+transport+of+Calcium+Green+Dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran.</a> Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).</li>
<li>Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+nervous+system+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging nervous system activity.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3(2009).</li>
<li>O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+neurons+retrogradely+and+anterogradely+labelled+with+calcium-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes.</a> J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).</li>
<li>Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dye+recording+using+retrogradely+transported+dye+in+the+chicken+spinal+cord%3A+staining+and+signal+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).</li>
<li>Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+Cord+Electrophysiology+II%3A+Extracellular+Suction+Electrode+Fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication.</a> J. Vis. Exp. (48), e2580(2011).</li>
<li>Smith, J. C., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+brainstem-spinal+cord+preparations+for+study+of+motor+systems+for+mammalian+respiration+and+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion.</a> J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+Cord+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spinal Cord Electrophysiology.</a> J. Vis. Exp. (35), e1660(2010).</li>
<li>Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+reduced+sensorimotor+connections+form+with+normal+specificity+despite+abnormal+muscle+spindle+development%3A+the+role+of+spindle-derived+neurotrophin+3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3.</a> J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).</li>
<li>Mentis, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+functional+impairment+of+sensory-motor+connectivity+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Neuron. 69, 453-467 (2011).</li>
<li>Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+sacral+neurons+involved+in+activation+of+the+lumbar+central+pattern+generator+for+locomotion+in+the+neonatal+rodent+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Soc.+Neurosci.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord.</a> Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).</li>
<li>O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+spatiotemporal+organization+of+neural+activity+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord.</a> Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).</li>
<li>Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+patterns+of+vestibular-mediated+synaptic+inputs+to+axial+and+limb+motoneurons+in+the+neonatal+mouse+assessed+by+optical+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording.</a> J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).</li>
<li>Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+functional+synaptic+connections+between+medullary+reticulospinal+neurons+and+lumbar+descending+commissural+interneurons+in+the+neonatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse.</a> J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; ليس لدينا ما يكشف.</p

نصف هنا بروتوكولاً بسيطاً ومنخفض التكلفة لإدخال الأصباغ إلى العصبونات والأعصاب والمسارات الشوكية. تتضمن هذه الطريقة تعريض مسارات تشريحية محددة لمحلول صبغة عالي التركيز طوال مدة عملية التحميل. يؤدي ذلك إلى وسم تراجعي للموقع المستهدف مع خلفية ضئيلة مقارنة بتقنيات الحقن المجهري، والتطبيق بالحمام، والتثقيب الكهربائي. ومع ذلك، تقتصر هذه الطريقة على المواقع في الجهاز العصبي التي يمكن فيها عزل حزمة من المحاور العصبية. علاوة على ذلك، وبما أن الصبغة تبدو وكأنها تنتشر على طول المحاور للوصول إلى أجسام الخلايا، فإن وقت التحميل سيعت...

إلى الوراء تحميل من الأعصاب، ومساحات، وجذور العمود الفقري مع الأصباغ الفلورية

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

وضع العلامات رجعي من الخلايا العصبية هي طريقة التشريحية مستوى 1،2 التي قد استخدمت أيضا لتحميل الكالسيوم والأصباغ الجهد حساسة إلى الخلايا العصبية 3-6. عموما، يتم تطبيق الأصباغ والبلورات الصلبة أو عن طريق الحقن الضغط المحلية باستخدام ماصات زجاجية. ومع ذلك، وهذا يمكن أن يؤدي إلى التخفيف من شدة العلامات صبغ وانخفاض، وخاصة عندما يطلب من عدة ساعات لنشر صبغ. هنا علينا أن نبرهن تقنية بسيطة ومنخفضة التكلفة لإدخال الأصباغ الفلورية وايون تراعي في الخلايا العصبية باستخدام ماصة شفط البولي ايثيلين مليئة الحل صبغ. هذا الأسلوب يوفر وسيلة يمكن الاعتماد عليها للحفاظ على نسبة عالية من الصبغة في اتصال مع محاور عصبية طوال الإجراء التحميل.

نصف في هذا البحث تقنية بسيطة ومنخفضة التكلفة لإدخال تركيزات عالية من الأصباغ الفلورية والحساسة للكالسيوم إلى العصبونات أو أي مسار عصبي باستخدام ماصة شفط من البولي إيثيلين.

يُعد الوسم الرجعي للعصبونات طريقة تشريحية قياسية1,2، استُخدمت أيضاً لتحميل الأصباغ الحساسة للجهد والكالسيوم داخل العصبونات3-6. ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إدخال تركيز عالٍ من صبغة فلورية أو صبغة حساسة للأيونات إلى العصبونات أو أي مسار عصبي باستخدام تقنية بسيطة ومنخفضة التكلفة. ويتم تحقيق ذلك من خلال إنتاج نوعين من الماصات أولاً، النوع الأول والنوع الثاني. ثم يتم توصيل أنبوب مطاطي مرن بالماصة من النوع الأول وتطبيق ضغط إيجابي لسحب المسار العصبي المستهدف إلى الماصة من النوع الأول، مع التحقق من إحكام السدادة.بعد ذلك، أدخل الماصة من النوع الثاني في الماصة من النوع الأول، واستخدم الماصة من النوع الثاني لسحب ما تبقى من A CSF من الماصة من النوع one. ثم أضف الصبغة إلى الماصة من النوع الأول، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هوائية. والخطوة النهائية هي تحضين الخلايا العصبية في الظلام لمدة تتراوح بين 6 إلى 20 ساعة.وفي النهاية، بعد إزالة الماصة من النوع الأول، يصبح التحضير جاهزاً للدراسات المورفولوجية، أو الفيزيولوجية الكهربائية، أو الدراسات في المختبر (in vitro). وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التطبيق في الحمام، أو الحقن في ساق الدماغ (BOS injection)، أو التثقيب الكهربائي، في أن مادة D يتم توصيلها إلى مجموعة عصبونية محددة. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال علوم الأعصاب، مثل النشاط، والترابط، والمورفولوجيا، وتوزيع عصبونات محددة.بشكل عام، تتطلب هذه التقنية التدريب، لا سيما لضمان عدم تخفيف الصبغة داخل الماصة من النوع الأول وعدم إدخال فقاعات هوائية فيها. ابدأ هذا الإجراء بسحب أنبوب البولي إيثيلين فوق لهب مصباح كحولي لإنتاج ماصتين قصيرتين بنهايات مدببة. أولاً، اسحب ماصة قصيرة من النوع الأول ذات طرف صغير يمكنه تثبيت الجذر أو المسار المستهدف بإحكام.بعد ذلك، اسحب ماصة من النوع الثاني ذات عمود أطول وأرفع وطرف دقيق للغاية يمكن إدخاله في الماصة من النوع الأول وصولاً إلى طرفها. بعد ذلك، قم بتوصيل الماصة من النوع الثاني بإبرة مقاس 19 gauge مثبتة بـ EC. ثم ضع النخاع الشوكي المعزول في حمام.قم بدمجه مع A CSF المبرد طوال عملية التحميل. بعد ذلك، ضع الماصة من النوع الأول على حامل قطب كهربائي بحيث يمكن توصيل فتحتها الخلفية بسهولة بمحقنة عبر أنبوب مرن. في هذا الإجراء، اسحب أولاً A CSF إلى الماصة من النوع الأول باستخدام محقنة.بعد ذلك، قم برسم المسار المحوري أو الجذر المراد ملؤه. ثم قم بإزالة الأنبوب المرن من الفتحة الخلفية. بعد ذلك، قم بتوصيل الماصة من النوع الثاني بمحقنة أخرى.أدخلها في الماصة من النوع الأول، التي تثبت سبيلاً محورياً أو جذراً عصبياً تحت المجهر. استخدم السرنجة المتصلة بالماصة من النوع الثاني لسحب السائل الدماغي الشوكي (A CSF) بحيث يغطي السائل الدماغي الشوكي (A CSF) المتبقي السبيلاً المحوري فقط. ثم اسحب الماصة من النوع الثاني من الماصة من النوع الأول.راقب مستوى A CSF لبضع دقائق للتحقق من وجود سدادة جيدة على المسلك المحوري أو الأعصاب. بعد ذلك، أذب الصبغة في A CSF أو 0.2%Triton X 100 في ماء مقطر مزدوج. اسحب المحلول إلى الماصة من النوع الثاني عن طريق تطبيق ضغط سلبي ضعيف على المحقنة المتصلة، مع الحرص على عدم سحب أي فقاعات هوائية.بعد ذلك، أدخل ماصة النوع الثاني التي تحتوي على الصبغة في محلول A CSF المتبقي في ماصة النوع الأول، ثم حرر الصبغة ببطء داخل A CSF باستخدام ضغط إيجابي خفيف عبر المحقنة. تأكد من عدم إدخال أي فقاعات هوائية أو التسبب في إزاحة النسيج المستهدف من داخل طرف الماصة. في حالة دخول فقاعة هوائية إلى ماصة النوع الأول أثناء حقن الصبغة، قم بسحب الفقاعة للخارج عن طريق تقريب طرف ماصة النوع الثاني من الفقاعة، ثم تطبيق ضغط سلبي ضعيف برفق باستخدام المحقنة الملحقة.بعد تحرر كمية كافية من الصبغة، اسحب الماصة من النوع الثاني. بعد ذلك، قم بتحضين النسيج في الظلام لمدة تتراوح من 6 إلى 20 ساعة، وذلك اعتماداً على نوع التجربة. وبمجرد السماح بمرور وقت كافٍ للامتلاء، اسحب القطب الكهربائي برفق من النسيج.بعد ذلك، تصبح الأنسجة جاهزة للتصوير أو الفحص النسيجي. يوضح المخطط التوضيحي التالي عملية تحميل ثلاثة صبغات فلورية مختلفة من الديكستران مقترنة في آن واحد في العصبونات الحركية، والعصبونات الحسية الواردة، والعصبونات البينية الشوكية؛ حيث تم ملء العصبونات الحركية والعصبونات الحسية الواردة العجزية عكسياً باستخدام Cascade blue Dextran و Texas red dextran عبر الجذور البطنية والظهرية على التوالي. بينما تم تحميل Green fluorescent dextran في العصبونات البينية الشوكية التي تصعد محاويرها عبر الحبل البطني.تظهر هنا صورة مجهرية بؤرية (confocal) لمقطع من النخاع الشوكي العجزي حيث تم وسم العصبونات تراجعيًا. يلاحظ أن الألياف الحسية الواردة الموسومة توجد بشكل أساسي في الجانب المماثل (ipsilateral). ومع وجود عدد قليل من الإسقاطات في الجانب المقابل، تكون العصبونات الحركية الموسومة في الجانب المماثل للجذر البطني المملوء، بينما تكون العصبونات البينية الموسومة في الجانب المقابل له كما يشير رأس السهم.بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق إضافية للإجابة على أسئلة جوهرية مثل الاتصالية الوظيفية، والتوازن بين الاستثارة والتثبيط، ونوع الجيوب، والتوزيع، وإنتاج النواقل العصبية في عصبونات الحقل DI. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفسيولوجيا العصبية للنخاع الشوكي وجذع الدماغ لعزل مجموعات عصبونية محددة باستخدام الصبغات الحساسة للأيونات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق الصبغات الفلورية و/أو الصبغات الحساسة للأيونات في العصبونات والألياف الحسية في النخاع الشوكي المعزول.

retrograde-loading-nerves-tracts-spinal-roots-with-fluorescent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

الكالسيوم هو رسول في كل مكان في الجهاز العصبي ، وضرورية لتحريك الافراج العصبي والتغييرات في قوة متشابك. هنا نظهر تقنية لتحميل كا 2 + - المؤشرات في محطات العصب ذبابة الفاكهة. نظهر أيضا تصنيع أجهزة المطلوبة ، والتأكيد على النقاط الحرجة للنجاح في هذه التقنية.

محطات التحميل العصب ذبابة الفاكهة مع مؤشرات الكالسيوم

صفنا السمات الهيكلية للنقاط الاشتباك العصبي الدبق العصبي العضلي في نسيج الرواية إعداد الداخل التدريجي من استخدام يرقات الذباب يعيش الأصباغ الفلورية مع المجهري متحد البؤر. نحن المسمى محطات عصبون تعيش مع الأجسام المضادة الأولية الفلورسنت لHRP ، وكذلك تصور الفضاء perisynaptic مع Dextrans الفلورسنت.

تصور لايف ذبابة الفاكهة الدبقية العصبية والعضلية ، تقاطع مع الأصباغ نيون

يعيش بين محاور التصوير الجذر الظهرية بعد بضع الجذور

النقل إلى الوراء من صبغة الفلورسنت تسميات فرعية السكان من الخلايا العصبية على أساس إسقاط التشريحية. المحاور صفت يمكن استهداف...

الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها<em&gt; في الجسم الحي</em

المصدر: Inal, M. A. et. al., التتبع الرجعي ل ذبابة الفاكهة  الخلايا العصبية الحركية الجنينية باستخدام الأصباغ الفلورية المحبة للدهون. J. Vis. Exp. (2020)يوضح هذا الفيديو طريقة وضع العلامات الرجعية ل ذبابة الفاكهة  الخلايا العصبية الحركية باستخدام الأصباغ المحبة للدهون. تدخل الصبغة إلى المحور العصبي ، وتنتقل إلى الوراء ، وتصنف الخلايا العصبية باللون الأخضر ، مما يسمح بتصور مفصل لمورفولوجيتها وإسقاطاتها تحت مجهر متحد البؤر.

وضع العلامات الرجعية للخلايا العصبية الحركية ذبابة الفاكهة باستخدام الأصباغ الفلورية المحبة للدهون

المصدر: Wang, J., { et al. تصور التعصيب المناعي للببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين في الأم الجافة للفئران مع التألق المناعي والتتبع العصبي. J. Vis. Exp. (2021).   يوضح هذا الفيديو طريقة لتتبع أصول الخلايا العصبية الحسية في الأم الجافية باستخدام الفحص المجهري الفلوري. يتم إدخال متتبع رجعي في الأم الجافية المكشوفة لفأر مخدر. يتم امتصاص المتتبع بواسطة المحاور العصبية الحسية وينتقل إلى الوراء إلى أجسام الخلايا داخل العقدة ثلاثية التوائم والعقد الجذرية الظهرية العنقية. ثم يتم تقسيم العقد ، وتلطيخها...

التحقيق في أصول الخلايا العصبية الحسية في الأم الجامدة باستخدام الفحص المجهري الفلوري

نقدم بروتوكولا يستخدم الفحص المجهري بفاصل زمني للإثارة ثنائية الفوتون لتصور ديناميكيات إصابات المحور العصبي والمايلين في الوقت الفعلي في وقت واحد. يسمح هذا البروتوكول المقترح بإجراء دراسات لكل من العوامل الجوهرية والخارجية التي يمكن أن تؤثر على مصير المحور العصبي النخاعي المركزي بعد الإصابة وتساهم في الإعاقة السريرية الدائمة.

ل فيفو السابقين يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي نموذج لتقييم آليات محور عصبي تنكس في الوقت الحقيقي

وصفنا تقنية لتسمية الخلايا العصبية والعمليات الخاصة بها عن طريق تقدمي أو رجعي التتبع الحقن في نوى الدماغ باستخدام إعداد في المختبر. نحن تعديل طريقة القائمة ط ن معمليا التتبع Electroporation للمن خلال الاستفادة من fluorescently المسمى المسوخ الماوس وأجهزة بصرية الأساسية من أجل زيادة دقة وضع العلامات.

موجهة بالليزر العصبية للبحث عن المفقودين في إإكسبلنتس الدماغ

هنا، نحن تصف طريقة لتحميل صبغة حساسة للكالسيوم من خلال الجذع العصب الضفدع في النهايات العصبية. كما نقدم بروتوكول لتسجيل وتحليل العابرين الكالسيوم سريع في النهايات العصبية الطرفية.

تحميل صبغ الكالسيوم إلى نهايات العصب الضفدع من خلال الجذع العصبي: تسجيل الكالسيوم العابر في الضفدع العصبي العضلي تقاطع

نحن نقوم بوصف طريقه للتتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام اصباغ فلورية للدهون.

التتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام الاصباغ الفلورية الليبوهيلليك

نحن نصف أساليب التفكيك الضوئي الفلورية لتحليل النقل المحوري للاعصاب في محاور عصبية واحدة من الأعصاب النخاعية من الفئران المحورة وراثيا التي تعبر عن بروتين الليفية العصبية تنشيطية ضوئية.

التصوير والتحليل لنقل الليفية العصبية في العصب الذبي الماوس المخزّن

تعلم تقنية تحميل الأصباغ الفلورية والحساسة للكالسيوم في الخلايا العصبية باستخدام ماصة البولي إيثيلين. هذه الطريقة البسيطة والمنخفضة التكلفة تُمكّن الباحثين من دراسة نشاط واتصال الخلايا العصبية بدقة.

إلى الوراء تحميل من الأعصاب، ومساحات، وجذور العمود الفقري مع الأصباغ الفلورية

استكشف المزيد من الفيديوهات