تحليل الرئوي نضوج خلية شجيري والهجرة خلال التهاب الشعب الهوائية التحسسي

الهدف من هذا الإجراء هو تقييم نضوج الخلايا المتغصنة الرئوية أو التيار المستمر وهجرتها أثناء التهاب مجرى الهواء التحسسي الناجم عن فال بومين في الفئران. يتم تحقيق ذلك عن طريق توعية الفئران أولا باستخدام Val Boomin ، يليه تحدي مجرى الهواء مع fitsy المسمى Val Boomin. بعد ذلك ، يتم حصاد الرئة والغدد الليمفاوية المنصفية.

أخيرا ، يتم تحضير معلق خلية واحدة من أنسجة الرئة والعقدة الليمفاوية. في النهاية ، يمكن تقييم حالة النضج والعدد المطلق للخلايا المتغصنة الموجودة في العقدة الليمفاوية المنصف بعد تحدي FITC Val Boomin عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الاستجابات المناعية الرئوية مثل ما إذا كانت الخلايا المتغصنة تخضع للنضوج ، والتعرض للمستضد المنخفض ، وما إذا كانت تهاجر إلى الغدد الليمفاوية المصنفة.

وإذا هاجروا ، فما هو معدل الهجرة. ابدأ بإضافة محلول Val Boomin Dropwise المحضر حديثا بنسبة واحد إلى واحد في أنبوب من الشب أثناء الدوامة. قلبي المزيج لمدة 30 دقيقة ثم املأ حقنة سعة مليلتر واحد ب 0.2 مل من الخليط.

باستخدام الإبهام على السبابة بيد واحدة ، أمسك الماوس المراد حقنه بواسطة خردة الرقبة بالقرب من قاعدة الجمجمة. ثم قم بحقن محلول Val Boomin alum في التجويف البريتوني للفأر باليد الأخرى. بعد سبعة أيام من الحقن الثاني من Val في الشب ، امسك فال مخدر في حساس للشب في الوضع الرأسي ، ثم استخدم ماصة أطراف الماصة المعقمة 100 ميكرولتر وفال المحضر حديثا في محلول fxi على NAS للفأر بطريقة متساقطة.

ابدأ بتوصيل قسطرة قياس 20 بملليلتر واحد من المحقنة. ثم بعد تأكيد القتل الرحيم للفأر ، افتح التجويف الصدري للحيوان على طول الطريق إلى الرقبة لفضح القصبة الهوائية للفأر وتقميتها. من الأهمية بمكان غسل الرئتين وإفراط القلب للتأكد من إزالة جميع البلاعم السنخية الملوثة والخلايا أحادية النواة الموجودة في الدم المحيطي.

وتأكد من تنفيذ هاتين الخطوتين التاليتين بعناية وبالطبع بيد ثابتة. الآن قم بإدارة PBS المثلج البارد مع EDTA ثلاث مرات من خلال القسطرة لشطف الجهاز التنفسي السفلي وإزالة الخلايا من الفراغات السنخية. ثم بعد تركيب حقنة سعة 10 ملليلتر بإبرة قياس 20 ، قم ببث الرئتين ب 10 ملليلتر من PBS الذي يحتوي على الهيبارين عبر البطين الأيمن للقلب.

تعتبر إزالة أي خلايا دم متبقية من الأوعية الدموية الرئوية كاملة عندما تتحول الرئتان إلى اللون الأبيض. بعد ذلك ، قم بإزالة الغدد الليمفاوية المنصف ، ووضعها في طبق منفصل. منع التبريد الملائم عن طريق تقليل التعرض للضوء للأنسجة.

ثم قم بتشريح الرئتين المنفحمتين ووضعها في طبق بتري باستخدام المقص ، وفرم الرئتين. بعد ذلك ، قم بهضم أنسجة الرئة عند 37 درجة مئوية في 250 وحدة لكل مليلتر من الكولاجيناز D.بعد 25 دقيقة من الحضانة ، أضف EDTA إلى الخليط لمدة خمس دقائق لإيقاف نشاط الكولاجيناز. أخيرا ، قم بتمرير شظايا الرئتين المهضومة عبر مصفاة خلية 100 ميكرون وتكمن كريات الدم الحمراء مع عازلة منخفضة التوتر.

قم بتفكيك الغدد الليمفاوية المنصف باستخدام الإبر الدقيقة وهضمها بالكولاجيناز كما هو موضح للتو للرئتين ، متبوعا بإجهاد الأنسجة من خلال مصفاة خلوية بعد داخل الصفاق والحساسية ومجرى الهواء. فال في التحدي. يمكن تقييم وجود الخلايا الالتهابية عن طريق تلطيخ الهيمات والتوين واليوزين في أقسام الرئة التمثيلية من السيطرة.

المعالجة بالمحلول الملحي ، الأنسجة خالية من الالتهاب كما يتضح من الرسم العلوي. في المقابل ، تنتشر الخلايا الالتهابية في جميع أنحاء أقسام الرئة من فال في الحساسة والتحديات كما يمكن رؤيته في الأسفل. يمكن استخدام صبغة التحول الحمضي الدورية الرسومية لتقييم إنتاج المخاط كما هو موضح في هذا الرسم السفلي.

يتم تأكيد تحريض التهاب الحساسية في مجرى الهواء بعد التحدي في Val في الفئران الحساسة من خلال وجود مخاط. على العكس من ذلك ، يظهر الغياب التام لإنتاج المخاط عن طريق التحكم. تخضع الفئران المعالجة بالمحلول الملحي كما هو موضح في الرسم العلوي التالي للتحدي ، وتخضع التجمعات العصبية الرئوية للنضج والهجرة اللاحقة إلى الغدد الليمفاوية المستنزفة.

هنا يظهر تحليل تمثيلي للغدد الليمفاوية المنصف للفأر أنه تم الكشف عن زيادة متواضعة ولكن ثابتة في نسبة الخلايا الإيجابية CD 11 C في الحساسة والتحديات مع Val Boomin مقارنة بالفئران المعالجة بالمحلول الملحي. علاوة على ذلك ، فإن تحليل عدد الخلايا المطلق ل CD 11 C إيجابي CD 11 B إيجابي Val Boomin يناسب الخلايا الإيجابية C من الغدد الليمفاوية المنصف في Val في الفئران الحساسة والتحديات التي تم تحديها أن زيادة أعلى بعدة أضعاف في أعداد DC تحدث في الفئران التي تواجه تحديات مقارنة بالحيوانات المعالجة بالمياه المالحة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لدينا فهم جيد حقا لتقنيتنا لتحليل نضوج الخلايا المتغصنة الرئوية وكذلك الهجرة.

وبمجرد أن تفهم هذه التقنية حقا ، يمكنك المضي قدما في تعديلها لتقييم استجابات الخلايا المتغصنة الرئوية لمسببات الأمراض الأخرى بالإضافة إلى العوامل التجريبية الأخرى.