تحليل الرئوي نضوج خلية شجيري والهجرة خلال التهاب الشعب الهوائية التحسسي

يهدف هذا الإجراء إلى تقييم نضج وهجرة الخلايا التغصنية (DC) الرئوية أثناء مسار التهاب الممرات الهوائية التحسسي المستحث بواسطة Val Boomin في الفئران. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تحسيس الفئران أولاً بـ Val Boomin، يليه تحدي الممرات الهوائية باستخدام Val Boomin المسمى بـ fitsy. بعد ذلك، يتم حصاد الرئة والعقد اللمفاوية المنصفية.

أخيرًا، يتم تحضير معلق خلوي أحادي من أنسجة الرئة والعقد الليمفاوية. وفي النهاية، يمكن تقييم حالة النضج والعدد المطلق للخلايا التغصنية الموجودة في العقد الليمفاوية المنصفية بعد تحفيزها بـ FITC Val Boomin عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية حول الاستجابات المناعية الرئوية، مثل ما إذا كانت الخلايا التغصنية تخضع للنضج نتيجة التعرض للمستضد، وما إذا كانت تهاجر إلى العقد الليمفاوية المصرفة.

وإذا حدث هجرة، فما هو معدل هذه الهجرة. ابدأ بإضافة محلول Val Boomin المُحضّر حديثاً قطرة تلو الأخرى بنسبة واحد إلى واحد في أنبوب يحتوي على alum مع استخدام جهاز الـ vortex. قلّب الخليط لمدة 30 دقيقة، ثم املأ سرنجة سعة 1 milliliter بكمية 0.2 milliliters من الخليط.

باستخدام الإبهام والسبابة لإحدى اليدين، أمسك الفأر المراد حقنه من منطقة الرقبة بالقرب من قاعدة الجمجمة. ثم قم بحقن محلول Val Boomin alum في التجويف الصفاقي للفأر باستخدام اليد الأخرى. بعد سبعة أيام من الحقنة الثانية من Val في alum، أمسك حيواناً مخدراً ومحسساً بـ val في alum في وضع عمودي، ثم باستخدام رؤوس ماصات معقمة، قم بنقل 100 microliters من محلول val في fxi المحضر حديثاً إلى منطقة NAS للفأر على شكل قطرات.

ابدأ بتوصيل قسطرة مقاس 20 بـحقنة سعة 1 مل. ثم بعد التأكد من القتل الرحيم للفأر، افتح التجويف الصدري للحيوان وصولاً إلى الرقبة للكشف عن القصبة الهوائية للفأر وتنبيبها. من الضروري جداً غسل الرئتين وتروية القلب لضمان إزالة جميع البلاعم السنخية والخلايا وحيدة النواة الملوثة الموجودة في الدم المحيطي.

وتأكد من تنفيذ الخطوتين التاليتين بعناية وبالطبع بيد ثابتة. الآن، قم بحقن PBS مع EDTA المبرد بالثلج ثلاث مرات عبر القسطرة لشطف الجهاز التنفسي السفلي وإزالة الخلايا من الحويصلات الهوائية. بعد ذلك، بعد تجهيز سرنجة سعة 10 milliliter بإبرة قياس 20 gauge، قم بتروية الرئتين بـ 10 milliliters من PBS المحتوي على heparin عبر البطين الأيمن للقلب.

تعتبر عملية إزالة أي خلايا دم متبقية من الأوعية الدموية الرئوية مكتملة عندما يتحول لون الرئتين إلى الأبيض. بعد ذلك، قم بإزالة العقد اللمفاوية المنصفية ووضعها في طبق منفصل. امنع خمود الفلورة عن طريق تقليل تعرض الأنسجة للضوء.

بعد ذلك، يتم تشريح الرئتين المرويتين ووضعهما في أطباق بتري، ثم تُقطع الرئتان إلى قطع صغيرة جداً باستخدام المقص. تالياً، يتم هضم أنسجة الرئة عند درجة حرارة 37 °C في 250 units/mL من إنزيم collagenase D. وبعد 25 دقيقة من الحضن، يُضاف EDTA إلى المزيج لمدة خمس دقائق لإيقاف نشاط إنزيم collagenase. وأخيراً، تُمرر قطع الرئة المهضومة عبر مصفاة خلايا بقطر 100 micron، ويتم التخلص من كريات الدم الحمراء باستخدام محلول منظم ناقص التوتر.

افصل العقد اللمفاوية المنصفية باستخدام إبر دقيقة ثم قم بهضمها باستخدام الكولاجيناز كما تم توضيحه للتو بالنسبة للرئتين، يلي ذلك تصفية النسيج عبر مصفاة خلايا بعد التحسيس داخل الصفاق والمجاري التنفسية. التحدي بـ Val. يمكن تقييم وجود الخلايا الالتهابية عن طريق صبغ الهيماتوكسيلين والإيوزين في مقاطع رئوية ممثلة من مجموعة الضبط.

في الحيوانات المعالجة بالمحلول الملحي، تخلو الأنسجة من الالتهابات كما يتضح من الرسم التوضيحي العلوي. وفي المقابل، تنتشر الخلايا الالتهابية في جميع أنحاء مقاطع الرئة من Val في الحيوانات التي تعرضت للتحسيس والتحدي، كما يظهر في الجزء السفلي. ويمكن استخدام صبغة حمض البيروديك لتقييم إنتاج المخاط كما هو موضح في هذا الرسم التوضيحي السفلي.

يتم تأكيد تحفيز الالتهاب التحسسي في الممرات الهوائية بعد التحدي بـ val في الفئران التي تم تحسيسها بـ Val من خلال وجود المخاط. وعلى العكس من ذلك، تظهر الفئران المجموعات الضابطة المعالجة بالمحلول الملحي غياباً تاماً لإنتاج المخاط، كما هو موضح في الرسم البياني العلوي؛ حيث تخضع خلايا dcs الرئوية بعد التحدي بـ val للنضج ثم تهاجر لاحقاً إلى العقد اللمفاوية التصريفية.

يظهر هنا تحليل نموذجي للعقد اللمفاوية المنصفية لدى الفئران أن هناك زيادة طفيفة ولكنها ثابتة في نسبة الخلايا الموجبة لـ CD 11 C تم رصدها في الحيوانات التي تم تحسيسها وتعريضها لـ Val Boomin مقارنة بالفئران المعالجة بالمحلول الملحي. علاوة على ذلك، فإن تحليل العدد المطلق للخلايا الموجبة لـ CD 11 C والموجبة لـ CD 11 B والموجبة لـ Val Boomin fits من العقد اللمفاوية المنصفية للفئران المحسسة والمعرضة لـ Val يظهر حدوث زيادة في أعداد الخلايا التغصنية (DC) بمقدار عدة أضعاف في الفئران المعرضة مقارنة بالحيوانات المعالجة بالمحلول الملحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لدينا فهم جيد للغاية لتقنيتنا المستخدمة في تحليل نضج الخلايا التغصنية الرئوية وكذلك هجرتها.

وبمجرد استيعابك لهذه التقنية بشكل جيد، يمكنك الانتقال إلى تعديلها لتقييم استجابات الخلايا التغصنية الرئوية لمسببات أمراض أخرى، بالإضافة إلى عوامل تجريبية أخرى.