تجميد مستورقة، التشعيع جزئي، والنسج

الهدف العام من التجربة التالية هو وضع مجموعة من الخلايا الجذعية السليمة المجاورة للأنسجة المستعصصة بالخلايا الجذعية داخل الباريان من أجل تحليل سلوكيات الخلايا الجذعية والذرية في الجسم الحي أثناء التجديد. يتم تحقيق ذلك عن طريق تخدير وشل حركة إما غير مشع أو مشع أوراق لمزيد من التلاعب. بعد ذلك ، يتم حماية الباريان غير المشع الثابت جزئيا بالرصاص ثم يتم تشعيعه بالأشعة السينية ، مما ينتج عنه باريان غير مصاب مع أنسجة مستعصية بالخلايا الجذعية جنبا إلى جنب مع الأنسجة المحمية التي تظل محملة بالخلايا الجذعية.

بدلا من ذلك ، يمكن زرع طعم الأنسجة المأخوذ من متبرع غير مشع في مضيف مشعع سابقا من أجل إنتاج باريان مع مجموعة معزولة من الخلايا الجذعية. فالي موجود داخل خلية جذعية. يتم الحصول على نتائج المضيف المكتسبة التي تظهر مجموعات الخلايا الجذعية المعزولة المجاورة للأنسجة المستعصية للخلايا الجذعية بواسطة الحمض النووي الريبي الجبل الكامل في الموقع اثنين من التهجين لجينات علامات الخلايا الجذعية.

لذا فإن الطرق الموضحة هنا تهدف إلى فهم مسطحات التجديد بشكل أفضل من خلال دراسة سلوك الخلايا الجذعية في كل من نموذج الزرع ونموذج التشعيع الجزئي ، والذي يسمح لنا باختبار ما إذا كانت الأنسجة المحيطة والبيئات المحلية التي توجد فيها هذه الخلايا الجذعية تؤثر أو تؤثر على سلوك هذه الانفجارات الجديدة أو الخلايا الجذعية. أثناء عملية التجديد ، قبل شهر إلى شهرين من التجربة ، قم بتغذية القاعدة وفقا للمخطوطة المصاحبة. من أجل الحصول على الحجم المطلوب في هذا العرض التوضيحي ، يتم اختيار القاعدة التي يتراوح طولها بين سنتيمترين إلى سنتيمترين وعرضها من ملليمترين.

ثم يتم تجويعه قبل ثلاثة إلى سبعة أيام من الاستخدام. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول Chloro tone مخدرا موضعيا خفيفا عن طريق إذابة 0.1 إلى 0.2٪ من الوزن لكل حجم في الماء الباري. ثم قم بتبريد المحلول على الجليد لزرع الأنسجة باستخدام موقد بنسن ، وثني أنبوبا شعريا بقطر داخلي 0.75 ملم عند سنتيمتر إلى سنتيمترين من النهاية إلى زاوية 90 درجة لقطع أنسجة الكسب غير المشروع.

ثم ثني أنبوبا شعريا آخر بقطر خارجي 0.7 ملم عند سنتيمتر إلى سنتيمترين من النهاية إلى زاوية 90 درجة لإنشاء ثقب في المضيف لتلقي الكسب غير المشروع. بعد ذلك ، قم بقص ورق الترشيح الأسود واتمان. رقم ثلاثة ، ورق الترشيح ، مسح كيم وورق لف السجائر وفقا للأحجام الموضحة في المخطوطة المصاحبة.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول هولت فيرس المعدل ومحلول هولت فريتر المشبع بكين. برد كلاهما إلى أربع درجات مئوية. ثم قم بإرفاق منديل كيم مطوي بمربع من Paraform.

ضعه على لوحة تبريد بلتيير أو أي جهاز تبريد آخر تحت مجهر تشريح. بعد ذلك ، قم بتشبع منديل كيم بمحلول هولت فريتر المبرد. ثم ضع مستطيلين من ورق الترشيح الأسود على مسحة كيم.

الآن ضع قطعة من ورق الترشيح Watman رقم اثنين في طبق بتري. بلل ورق الترشيح بمحلول هولت فريتر. ثم قم بتبريد الطبق على الجليد للإشعاع الجزئي.

ضع بطانة ورقية أكبر في طبق أكبر يشبه زراعة الأنسجة. بلل ورق الترشيح بمحلول هولت فريتر. ثم برد الطبق على الثلج.

في هذا الإجراء ، املأ طبق بتري بمحلول كليون مبرد. ماصة Planaria في الطبق للزرع. قم بتخدير مضيف واحد ومتبرع واحد فقط في كل مرة.

للإشعاع الجزئي ، يمكن تخدير العديد من في وقت واحد. ثم اترك الباريا تنقع في محلول الكلون لمدة خمس إلى 10 دقائق حتى تصبح بلا حراك. اشطف الباريا عن طريق ماصتها في طبق مليء بمحلول هولت فريتر المبرد.

بعد ذلك ، قم بتثبيت منطقة البلين عن طريق ماصتها على أوراق الترشيح السوداء المشبعة بمحلول هولت الحقيق المبرد. ثم قم بتوجيههم الجانب البطني لأسفل باستخدام زوج من الملقط. الآن ضع طبق بتري المبرد الذي تم إعداده مسبقا في دلو ثلج يتناسب مع مصدر أعلى للأشعة السينية.

رتب منطقة البلين المخدرة في طبق بتري عن طريق تحريك أوراق الترشيح السوداء. ثم انقلها إلى المصدر العلوي ، قم بوضع دلو الثلج بحيث يتم تقليل المسافة من أنبوب الكاثود إلى المنبوذ. وبالتالي تعظيم معدل الجرعة الفعالة.

ثم ضع دروع الرصاص بين المنبوذ وأنبوب الكاثود لجرعة الأشعة السينية. إذا كان الاستئصال الكامل للخلايا الجذعية من المناطق غير المحمية مطلوبا ، فقم بتسليم 30 رمادي أو أكثر. مباشرة بعد انبعاث الأشعة السينية ، انقل الباريان إلى ماء باري.

بعد ذلك ، اترك الماء الباري يسخن إلى درجة حرارة الغرفة لتخرج نفسها من ورق الترشيح الأسود. اكتملت عملية التشعيع الجزئي الآن. لبدء هذا الإجراء تحت مجهر التشريح ، قم بترتيب منطقة المضيف المخدر والمتبرع على مرشحات سوداء مستطيلة منفصلة على مسحة Kim ، والتي تم تبريدها بالفعل على لوحة البلتييه أو البرودة.

استخدم أنبوبا شعريا بقطر داخلي 0.75 ملم لقطع سدادة الكسب غير المشروع من المتبرع. ثم استخدم زوجا من الملقط لوضعه على جزء بعيد عن الطريق من المضيف. ثم استخدم أنبوبا شعريا بقطر خارجي 0.7 ملم لإزالة سدادة من المضيف.

بعد ذلك ضع الكسب غير المشروع في الحفرة. انقل المضيف المزروع على ورق الترشيح الأسود المستطيل إلى طبق بتري المحضر مسبقا. بلل قطعة من ورق الدرفلة بمحلول هولت فريتر المشبع بكين.

ثم ضعه فوق المضيف المزروع. بعد ذلك ، انقع أربع قطع من ورق الترشيح الذي يغلف محلول هولتر المشبع ، وفي حالة نقع المضيف المزروع لاحقا أربعة قطع من القطع ، يقوم كيم بمسح غلاف محلول هولت فريتر المشبع. ضعها فوق أوراق الترشيح.

بعد ذلك ، أغلق الغطاء. ضع طبق بتري على الثلج. ثم انقل المتبرع الباريان إلى الماء الباري للتعافي والتجديد.

عند اكتمال جميع عمليات الزرع ، ضع الباريان المزروع في حاضنة 10 درجات مئوية طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، انقله إلى طبق بتري مليء بماء باريان. اسمح للباريان إما بإزاحة نفسه من ورق الترشيح أو إزالته برفق باستخدام ملقط وتغيير ماء الباريان مرة كل يومين إلى ثلاثة أيام بعد ذلك.

تهجين ثقب جبل في الموقع في الباريان المقاوم للإشعاع ، ولكن المحمي بالكامل بعد ثلاثة أيام من التشعيع توزيعا للخلايا الجذعية لا يمكن تمييزه عن نوع البريان البري. من ناحية أخرى ، بالنسبة للباريان الذي كان محميا جزئيا فقط ، يبدو أن ترك الأجزاء الأمامية والخلفية المكشوفة للخلايا الجذعية مفصولة من المناطق غير المحمية. يوضح هنا المناظر الظهرية والبطنية لبيريان تم زرعه بنجاح.

بعد ثلاثة أيام من الزرع ، يكون الكسب غير المشروع مرئيا بوضوح على كل من الأسطح الظهرية والبطنية ، ويحيط به نسيج مميز غير مصطبغ في واجهة مضيف الكسب غير المشروع. ومع ذلك ، فإن عملية الزرع غير الناجحة لا تظهر أي أنسجة طعم مرئية في موقع الزرع. كشف التهجين في الموقع الكامل عن وجود الخلايا الجذعية فقط في موقع الكسب غير المشروع أو حوله ، مما يدل على نجاح عملية الزرع بمجرد إتقانها.

يمكن إجراء عمليات الزرع في أقل من خمس دقائق لكل منها. مع معدلات نجاح تقترب من 90 إلى 100٪ ويمكن توسيع نطاق التشعيع الجزئي بشكل كبير. بافتراض أن حجم مجال جهاز التطعيم الخاص بك كبير بما فيه الكفاية.