توصيف الآليات الجزيئية لل

يوضح هذا الفيديو طريقة لاستحثاث الساد (الكتاراكت) باستخدام الأشعة فوق البنفسجية في الجرذان. ثم يتم دراسة الآليات الجزيئية المشاركة في تطور الساد باستخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (quantitative real-time PCR) والكيمياء النسيجية المناعية الخلوية. أولاً، يتم تعريض عين الجرذ للأشعة فوق البنفسجية لتحفيز تكوين الساد.

تُستخدم العين الأخرى كعينة ضابطة. بعد ذلك، يتم تشريح العدسات ومعالجتها للحصول على RNA لتقييم مستويات تعبير CAS B الثلاثة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (quantitative real-time PCR)، أو يتم صبغها باستخدام جسم مضاد ضد الكاسبيز المشطور (cleaved caspase) لتقييم تعبير وتوطين البروتين النشط.

في نهاية المطاف، تؤكد نتائج هذه المقايسات زيادة في mRNA لإنزيم caspase three والتعبير عن البروتين النشط في نواة خلايا العدسة بعد التعرض لـ UVR. وتكمن الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول مقارنة بالطرق الحالية في استخدامه لمصدر UVR أحادي النطاق الضيق وجهاز تثبيت عالمي للجرذان، مما يسمح لنا بتعريض الحيوانات بشكل آمن ودقيق لطيف وجرعة UV محددة جيداً. علاوة على ذلك، فقد طبقنا تقنيات بيولوجية حديثة، وهي quantitative R-T-P-C-R، والكيمياء النسيجية المناعية لدراسة موت الخلايا المبرمج في العدسة، حيث يمكن لمنهجية Dodi أن توفر معلومات حول الآليات الجزيئية لإعتام عدسة العين الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية.

ويمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على نماذج تجريبية أخرى مثل سرطانات الجلد الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية أو الإشعاع، وعلوم الأعصاب السلوكية لدى الجرذان، وأبحاث العين التجريبية مع التركيز على الموت الخلوي المبرمج (apoptosis). ابدأ هذا البروتوكول بوضع أنثى جرذ من سلالة Sprague dolly مخدرة في مثبت جرذان، وقم بشد الأحزمة حتى يتم تثبيت الجرذ دون الضغط على الجذع. ولتحفيز تمدد حدقة العين، ضع قطرة إلى قطرتين من محلول tpic aide بتركيز 10 milligram per milliliter في كل عين.

ثم ضع المرهم على العين غير المعرضة وقم بتغطيتها بشريط أسود لحجب الأشعة فوق البنفسجية. بعد ذلك، ضع الحيوان في أداة التثبيت بحيث تكون العين المكشوفة في وضعية تسمح باستقبال حزمة ضيقة من الأشعة فوق البنفسجية بطول موجي 300 nanometers وبعرض كامل عند نصف القيمة القصوى يبلغ 10 nanometer، يتم توليدها من مصباح زئبقي عالي الضغط. قم بتعريض الجرذ من جانب واحد بجرعة دون العتبة تبلغ 1 kilojoule per meter squared من UVRB لمدة 15 minutes بعد التعريض.

أزل الشريط اللاصق عن العين غير المعرضة وضع المرهم في كلتا العينين. أعِد الحيوان إلى قفصه وغطّه بورق ناعم للحفاظ على دفئه. راقب الحيوان حتى يستعيد وعياً كافياً للحفاظ على وضعية الانبطاح الصدري.

بعد ذلك، أعد الجرذ الذي تم استرداده إلى قفصه مع الجرذان الأخرى. 1 و5 و24 و120 ساعة. اتبع ما يلي بعد التعرض.

ضع العين المستأصلة من الجرذ الذي تم قتله رحيمًا بحيث تكون القرنية للأسفل والجانب الخلفي للأعلى على منديل ورقي ناعم. بعد ذلك، وبالعمل تحت مجهر تشريحي، استخدم كانيولا عيار 27 لإحداث ثقب صغير بالدفع بشكل مماسي للصلبة لتجنب إتلاف العدسة القريبة جدًا من الصلبة.

بعد ذلك، وباستخدام مقص جراحة العيون، يتم القص بشكل دائري خلف الليمبس مباشرةً حتى يمكن رفع الجزء الخلفي من الصلبة. ثم وباستخدام ملاقط منحنية غير حادة، يتم رفع العدسة ووضعها في محلول ملحي متوازن وإزالة بقايا الجسم الهدبي من العدسة. يجب ألا يتم الاحتفاظ بالعدسة في المحلول الملحي المتوازن لأكثر من 10 minutes.

بعد عملية التشريح، ضع العدسة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 mL يحتوي على 350 µL من ra، وهو منظم تحلل (lysis buffer) واحد من مجموعة nucleo spin RNA two لعزل الـ total RNA، و3.5 µL من Beamer keto ethanol. تُحضن العينة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التحضين، استخدم إبرة لتجنيس العدسة ميكانيكياً حتى لا يتبقى سوى النواة الصلبة. سيقوم منظم التحلل بتحليل قشرة العدسة ومحفظتها.

قم بإزالة النواة من المزيج وتخلص منها. تُخزن العينات فوراً عند درجة حرارة -70 °C. يمكن تخزين العينات لمدة تصل إلى عام واحد حتى يحين وقت المتابعة.

قم بجمع العينات وتنقية الـ RNA وفقاً لبروتوكول تنقية الـ RNA الكلي من الخلايا المستزرعة والأنسجة المرفق مع الطقم. تُحفظ عينات الـ RNA عند درجة حرارة -70 °C. وللتحقق من الإزالة الكافية للـ DNA من كل عينة، قم بتضخيم الـ DNA باستخدام بادئات متخصصة لـ P 53 DNA تحت الظروف التالية.

الخطوة 1: 95 °C لمدة دقيقتين. الخطوة الثانية: لمدة 40 دورة، 95 °C لمدة 20 ثانية، ثم 55 °C لمدة 20 ثانية.

72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية. الخطوة 3: 72 درجة مئوية لمدة سبع دقائق. بمجرد اكتمال التشغيل، يتم فصل النواتج باستخدام هلام AROS بنسبة 1.5%.

للكشف عن ناتج PCR النوعي للحمض النووي DNA المكون من 243 زوجاً قاعدياً، تأكد من تضمين عينة ضابطة موجبة وأخرى سالبة. في حال تمت إزالة الـ DNA بنجاح، فلن تظهر نواتج PCR. يجب أن تظهر حزمة فقط في مسار الضابط الموجب، مع استخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop لقياس تركيز عينات الـ RNA وتحديد نسبة الـ RNA إلى البروتين.

إذا كانت نسبة امتصاص عينة الـ RNA عند 260/280 تبلغ 2.0 أو أكثر، فإن عينة الـ RNA تعتبر نقية. بعد ذلك، يتم تخليق الـ cDNA باستخدام 1 µg من الـ RNA وبواسطة طقم تخليق شريط الـ cDNA الأول لتقنية R-T-P-C-R، ثم تُحفظ عينات الـ cDNA عند درجة حرارة -20 °C. ولإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (quantitative realtime PCR)، تُوضع العينات في طبق يحتوي على 96 بئرًا في ثلاث مكررات.

يجب أن تحتوي كل بئر على 1 µL من عينة cDNA مدمجة مع المزيج الرئيسي (master mix) لمقايسة TaqMan للتعبير الجيني لـ caspase-3 في طبق منفصل. يتم تطبيق نفس العينات، ولكن باستخدام مقايسة TaqMan للتعبير الجيني لـ 18s. بعد ذلك، ولإنشاء منحنى قياسي للتحليل، يتم إجراء تخفيف تسلسلي لـ 1 µL من cDNA مستخلص من ثلاث عدسات غير معرضة تم اختيارها عشوائياً.

قم بإجراء تخفيفات متسلسلة جنباً إلى جنب مع الـ CDNA المستخلص من العينات، وذلك في طبق يحتوي على 96 بئراً في كل طبق. قم بطرد السوائل إلى أسفل البئر باستخدام جهاز الطرد المركزي، ثم قم بتشغيل الطبق على نظام iCycler myiQ للكشف عن PCR في الوقت الحقيقي أحادي اللون.

بعد انتهاء عملية التشغيل، وباستخدام برنامج IQ الخاص بي، يتم إنشاء منحنى قياسي يوضح عدد الدورات عند العتبة كدالة للتركيز النسبي للمعاير للتخفيفات المتسلسلة في كل لوح. استخدم المنحنى القياسي لتحديد التركيز النسبي لـ CDNA في العينة المقاسة باستخدام عدد دورات العتبة لكل عينة.

وأخيراً، حدد مستوى تعبير الجينات المستهدفة من خلال ربط التركيز النسبي لـ cDNA المستهدف بـ cDNA لـ 18 s كعنصر تحكم داخلي. ولإجراء الصبغ الكيميائي النسيجي المناعي، قم بتشريح العين ووضعها في PBS بعد التشريح. ثم انقل العين إلى أنبوب مملوء بـ 4%para formaldehyde واحضنها على الثلج لمدة 20 دقيقة.

باستخدام ماصة دقيقة، قم بإزالة البارافورمالدهيد. ثم انقل العين إلى أنبوب إينور بسعة 2 مل يحتوي على 1 مل من PBS بارد جداً، واتركها في الحاضنة لمدة 20 دقيقة على الثلج. بعد ذلك، انقل العين إلى أنبوب إينور يحتوي على 30% sucrose.

يتم التحضين عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. وفي اليوم التالي، تُستخدم الملقط لنقل العين إلى كوب مملوء بوسط درجة حرارة القطع المثلى أو وسط OCT. توضع العين في وضع مستقيم من أجل التقطيع.

بعد ذلك، ضع الكوب على الثلج الجاف لتجميده وتخزينه عند درجة حرارة -70 °C حتى يحين وقت تقطيع العين لتحليلها بواسطة المجهر الفلوري. ابدأ بتثبيت العين المغمورة في مركب OCT على قاعدة التثبيت في المبرد (cryostat) لإجراء التقطيع التجميدي. حاول محاذاة الجانب الأكثر تسطحاً من عدسة العين ليكون موازياً لحافة السكين.

قم بقص ثلاثة مقاطع سهمية وسطية بسمك 5 ميكرون من جزء مركزي من كل عدسة. تخلص من ستة مقاطع على الأقل بين المقاطع المتتالية لتجنب صبغ النوى نفسها في مقاطع مختلفة. بمجرد قص المقطع، ضع شريحة زجاجية فوقه بلطف.

بعد ذلك، يجب أن يلتصق المقطع بالشريحة. تُترك الشرائح لتجف في الهواء قبل الاستخدام. يمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة 70- درجة مئوية حتى يحين وقت تلوينها.

اترك الشرائح حتى تعود إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإجراء صبغ بالأجسام المضادة لتحديد cleaved CAS phase three كما هو موضح في المستند المرفق وفي غضون بضع ساعات، افحص الشرائح تحت مجهر فلوري. قم بعد جميع نوى الخلايا الطلائية للعدسة.

سجل عدد جميع نوى الخلايا الظهارية للعدسة من خلال عد الخلايا المصبوغة بـ DAPI، وعدد النوى الإيجابية لـ caspase three من خلال عد الخلايا المسمى بـ active caspase three. قم بعد الخلايا ثلاث مرات لكل مقطع.

يعد كاسباز 3 (Caspase three) بروتياز رئيسياً في مرحلة التنفيذ من عملية الموت الخلوي المبرمج. المجهر الإلكتروني النافذ. وتدعم الدراسات أن الأشعة فوق البنفسجية (UVR) تحفز الموت الخلوي المبرمج في العدسة.

تؤكد الدراسات التجريبية حول الموت الخلوي المبرمج أن caspase three يعد مؤشراً موثوقاً لهذا النوع من الموت الخلوي. ولتحديد ما إذا كان التعرض للأشعة فوق البنفسجية (UVR) في الجسم الحي يحفز تعبير caspase three، تم قياس تعبير mRNA في العدسة البلورية بواسطة QPCR بعد 1 و 5 و 24 و 120 ساعة من التعرض في الجسم الحي لجرعة مقدارها 1 kJ/m² من الأشعة فوق البنفسجية عند طول موجي 300 nm. ثم تم رسم متوسط نسبة CASP three mRNA إلى 18S rRNA بين العدسة المعرضة والعدسة المقابلة غير المعرضة لكل نقطة زمنية.

يوضح هذا الشكل تعبير mRNA لـ caspase three بمرور الوقت ويثبت عملية نسخ apoptosis. وقد أدى اختبار caspase three كعلامة في عدسة العين in vivo بعد التعرض لـ far UVR orthogonal إلى تباين ذو دلالة إحصائية في إشارة mRNA لـ caspase three بين فترة كمون مدتها 120 ساعة مقابل فترات كمون أقصر. كما تمت مقارنة تعبير caspase three في عدسة معرضة وأخرى غير معرضة بواسطة المجهر الفلوري المناعي كما هو موضح في هذه الصور بعد 24 ساعة من التعرض، حيث تم وسم النوى مما يشير إلى وجود active caspase three.

توفر طريقة التلوين المناعي هذه معلومات قيمة حول التوزيع المكاني للخلايا الظهارية الملحقة بعلامة موت الخلايا المبرمج caspase three في العدسة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز الساد الناتج عن UVR تجريبياً ودراسة الآلية الجزيئية للساد المستحث بـ UVR باستخدام qPCR والكيمياء النسيجية المناعية.