في Electroporation البيضة في الدماغ المتوسط ​​الفرخ لدراسة وظيفة الجينات في الخلية العصبية الدوبامين التنمية

توضح هذه التجربة عملية التثقيب الكهربائي في البيضة (in ovo electroporation) للدماغ المتوسط في جنين الدجاج لدراسة تأثير التعبير الجيني الخارجي على تطور الدماغ المتوسط وتمايز الخلايا العصبية الدوبامينية. أولاً، يتم حقن الدماغ المتوسط لأجنة الدجاج في المرحلة 11 وفقاً لتصنيف هاميلتون-هامبورغر (hamburger Hamilton) بالبلازميد المطلوب، DNA، لاستهداف الـ DNA الخارجي تحديداً في حويصلة الدماغ المتوسط النامية. بعد ذلك، وباستخدام أقطاب كهربائية صغيرة مصنعة خصيصاً، يتم إجراء التثقيب الكهربائي لحويصلة الدماغ المتوسط لإيصال الـ DNA الخارجي تحديداً إلى الخلايا السلفية العصبية في الدماغ المتوسط.

بعد ذلك، يتم حصاد أجنة المرحلة 23 التي تظهر تعبيراً جيداً لبروتين M cherry في الدماغ المتوسط، ومن ثم إعداد مقاطع عرضية مثالية للدماغ المتوسط. وفي النهاية، يمكن أن يوضح تحليل الصبغ المناعي لعلامات العصبونات الدوبامينية، مثل tyrosine hydroxylase، تمايز السلفات العصبية إلى عصبونات دوبامينية ناضجة محفزة عن طريق تعبير الجينات المستهدفة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية الأخرى للتثقيب الكهربائي داخل البيضة في قدرة هذا البروتوكول على تحقيق تثقيب كهربائي محدد للغشاء لدراسة تمايز العصبونات الدوبامينية في الدماغ المتوسط.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول تطور الدماغ المتوسط، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أجزاء أخرى من الجهاز العصبي لإجراء تحليل تخطيط المصير، وللبحث في تنظيم التعبير الجيني. ومن أجل الحصول على أجنة hamburger Hamilton في المرحلة 11، ضع كل بيضة مخصبة على جانبها وضع علامة بشرطة قلم رصاص في الأعلى. ثم ضع الصواني على جهاز هزاز في حاضنة مرطبة ومسخنة مسبقاً.

تحقق من الرطوبة ومستوى الماء كل 24 ساعة عند الساعة 41 بعد الإخصاب. أخرج البيض من الحاضنة واحفظه في درجة حرارة الغرفة. نظف سطح كل بيضة باستخدام 70% ethanol ثم امسحه.

الآن، ضع قطعتين من شريط لاصق بطول 4 cm جنباً إلى جنب على البيضة لتشكيل مستطيل كبير فوق علامة القلم الرصاص. قم بتثبيت الشريط اللاصق جيداً على البيضة لتحديد إطار النافذة باستخدام سرنجة سعة 10 mL متصلة بإبرة مقاس 18 gauge. اثقب قشرة البيضة مع إمالة الإبرة بعيداً عن المح، وذلك لتجنب إزعاج أو إتلاف الجنين.

اسحب خمسة ملليلتر من الألبومين من البيضة. نظف الإبرة باستخدام ethanol بتركيز 70%. جفف الإبرة قبل ثقب البيضة التالية.

أدخل الإعدادات الخاصة بجهاز سحب الماصات الدقيقة باللهب. بعد ذلك، قم بسحب أنابيب شعيرية رقيقة الجدران لتحويلها إلى إبر حقن باستخدام ماصة P 10. ثم اسحب من 5 إلى 10 µL من محلول البلازميد في طرف ماصة شعيرية طويل.

بعد ذلك، قم بتعبئة الإبرة الزجاجية ببطء بحيث يتكون عمود متصل وخالٍ من فقاعات الهواء. ضع الإبرة المعبأة في حامل الإبر المتصل بالمتحكم الدقيق والمحقن الدقيق. والآن، وتحت مجهر التشريح، وباستخدام خلفية داكنة لتحسين رؤية الإبرة، قم بقص الإبرة باستخدام مقص زنبركي عند النقطة التي يتوقف عندها السائل الأخضر.

قص نافذة بقطر يتراوح بين 2 إلى 2.5 سنتيمتر من ثقب الإبرة السابق، وذلك لسحب الألبومين. قم بتدوير البيضة في إحدى يديك أثناء القص.

تذكر تنظيف المقص باستخدام منديل كيم (kim wipe) مشبع بـ 70%ethanol بين كل بيضة وأخرى. انتقل لفحص جنين الدجاج تحت مجهر التشريح. إذا لزم الأمر، يمكن تصور الجنين عن طريق حقن 20%India ink مفلتر بـ 0.22 micrometer في PBS تحت جنين الدجاج. ضع الجنين بشكل موازٍ لمسار الإبرة مع توجيه الرأس بعيداً عنها.

اثقب الأنبوب العصبي ببطء بزاوية 45 درجة عند نقطة الالتقاء بين الدماغ المتوسط والدماغ الخلفي. ابدأ الحقن باستخدام محاقن pico spritzer الدقيقة مع ضبط مدة الحقن عند 25 milliseconds. اضبط الوقت بناءً على تشذيب الإبرة، مع ملء الحويصلة العصبية التي تمثل الدماغ المتوسط فقط بـ plasmid DNA الذي يحتوي على صبغة fast green.

بعد سحب إبرة الحقن، ضع ثلاث قطرات من محلول البنسلين والستريبتومايسين (pen strep) على الجنين. تحقق من إعدادات جهاز التثقيب الكهربائي B-T-X-E-M-C eight 30 لضمان كفاءة عملية التثقيب الكهربائي. عند موضع الدماغ المتوسط البطني، ضع أقطاب البلاتين الصغيرة المصممة خصيصاً على شكل حرف L عند نفس المستوى الأفقي لقاع الأنبوب العصبي، بحيث يتوسط الدماغ المتوسط للجنين القطبين الكهربائيين.

اضغط على مفتاح قدم جهاز BTX مرة واحدة ولاحظ فقاعات الهواء المتولدة حول الأقطاب الكهربائية. بعد كل عملية تثقيب كهربائي ناجحة، قم بإزالة الأقطاب الكهربائية من البيضة بعناية ومسحها. وباستخدام منديل كيميائي مبلل بـ 70% ethanol، ضع ثلاث قطرات أخرى من محلول pen strep على الجنين.

الآن قم بتغطية النافذة بقطعة من شريط التغليف الشفاف بمقاس 5 cm في 5 cm. دون لمس محتويات البيضة، أحكم إغلاقها جيداً ثم أعد البيض إلى الحاضنة مع إيقاف تشغيل الأقراص الدوارة. وعند الوصول إلى المرحلة المطلوبة، يتم جمع الأجنة الحية في طبق بتري مشترك مملوء بـ PBS لكل حالة من الحالات التجريبية.

بعد ذلك، يُستخدم مجهر تشريح فلوري. يتم فحص الأجنة التي تم جمعها للكشف عن تعبير m cherry، ثم تُنقل الأجنة الموجبة إلى آبار منفصلة في طبق يحتوي على 24 بئراً. تُمَلأ كل بئر بـ 1 mL من para formaldehyde بتركيز 2% مُحضّر حديثاً، وتُحضن لمدة ثلاث ساعات عند درجة حرارة 4 °C.

اغسل الأجنة المثبتة في PB S ثلاث مرات، ثم ضع الأجنة في محلول سكروز بنسبة 15% حتى تتوازن. كرر عملية الموازنة في محلول سكروز بنسبة 30%، ثم قم بتضمين كل جنين في OCT مع توجيه الأجنة بشكل صحيح لإنتاج مقاطع عرضية مثالية للدماغ المتوسط من أجل التحليلات اللاحقة.

قم بتحضير مقاطع من الدماغ المتوسط السميك بسمك 18 ميكرون باستخدام الميكروتوم المجمد (cryostat) للتحليل اللاحق في مقايسة التثقيب الكهربائي في البيضة (in ovo electroporation) للدماغ المتوسط في جنين الدجاج. يتم حقن أجنة الدجاج في المرحلة 11 بمزيج بلازميدي يتكون من علامة m cherry الفلورية والجينات المستهدفة، بالإضافة إلى متتبع مصبوغ باللون الأخضر السريع (fast green) لمراقبة عملية الحقن. بعد التثقيب الكهربائي للدماغ المتوسط، يتم تحضين الأجنة لفترة إضافية، ثم يتم جمع الأجنة الإيجابية لعلامة m cherry وتثبيتها وطمرها.

بعد ذلك، يتم تحضير مقاطع تجميدية للدماغ المتوسط. وتُحلل العينات عن طريق الصبغ المناعي باستخدام علامات الدماغ المتوسط مثل tyrosine hydroxylase في أجنّة الدجاج التي تم حقنها وعمل تخطيط كهربائي لها بنجاح. وعادة ما يكون تعبير m cherry مرئياً في منطقة الدماغ المتوسط بعد مزيد من النمو، وذلك باستخدام تعبير m cherry كعلامة للحقن.

يتم بعد ذلك تثبيت الأجنة التي تظهر تعبيراً صحيحاً لـ m cherry، ثم طمرها وتوجيهها لتحضير مقاطع تجميدية من الدماغ المتوسط. وهنا، يتم فحص تحديد المصير الدوباميني في السلائف العصبية التي خضعت للتثقيب الكهربائي من خلال التوضع المشترك لـ m cherry والجين الموسوم بـ flag مع واسم العصبونات الدوبامينية tyrosine hydroxylase. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قصر التعبير الجيني إقليمياً على سلائف العصبونات الدوبامينية في الدماغ المتوسط الجنيني، بما في ذلك كيفية حقن بنيات DNA تحديداً في منطقة الدماغ المتوسط، وكيفية تحديد موقع التثقيب الكهربائي بدقة باستخدام أقطاب كهربائية صغيرة مصنعة خصيصاً باتباع هذا الإجراء.

يمكن استخدام طرق أخرى، مثل الإغلاق بوساطة RNI أو التعبير عن المعززات المرتبطة بالجينات المراسلة، لدراسة وظيفة الجينات وتنظيمها في مناطق وأنواع خلوية محددة من الجهاز العصبي.