الأساسية Caenorhabditis ايليجانس طرق: التزامن والمراقبة

سنعرض لكم في هذا الفيديو كيفية مزامنة ديدان C elegans عند مرحلة المستوى الأول. وتعد هذه الطريقة بسيطة ولكنها شائعة جدًا، لذا ستكون مفيدة للغاية إذا كنت لا تزال في مرحلة المبتدئين.

إذا كنت خبيراً في لغة C، فقد تجد هنا بعض النصائح لتحسين هذا البروتوكول. تعتمد أساسية مزامنة الديدان على المقاومة النسبية للأجنة مقارنة بالديدان البالغة لمحلول الهيبوكلوريت القلوي. وبذلك، يتم تحضين هذه الديدان البالغة التي تحتوي على العديد من الأجنة بداخلها مع محلول الهيبوكلوريت بحيث يتم قتل البالغين وتبقى الأجنة فقط.

يتم تحقيق الجزء الثاني من المزامنة من خلال نقص الغذاء، بحيث لا تتطور الأجنة إلى ما بعد المرحلة اليرقية الأولى (L1) حتى وإن فقست في أوقات مختلفة. تتمثل الخطوة الأولى لبدء بروتوكول التزامن السريع (blitzing protocol) في الحصول على ديدان في مرحلة وضع البيض مع وجود عدة بيضات مبعثرة على الطبق. استخدم وسط M9 لاستعادة الديدان البالغة بغرض الحصاد.

كذلك، يمكن كشط الأجنة الموجودة بالفعل على سطح الطبق باستخدام مادة لينة مثل قطعة من فيلم الأشعة السينية، ثم غسل البكتيريا المسترجعة بعدة غسلات بـ M9. وعادة ما تكون غسلتان كافيتين. وبمجرد غسل الديدان، يحين وقت إضافة محلول التبييض الذي تم تحضيره حديثاً وفقاً للتفضيلات المتبعة.

تحكم في وقت التحضين أثناء رج الأنبوبة. يمكنك مراقبة ظهور البالغين تحت المجهر الستيريو. وبمجرد ألا يتبقى سوى عدد قليل جداً من الجثث، أوقف التفاعل عن طريق إضافة M nine حتى تمتلئ الأنبوبة تماماً.

لإكمال البروتوكول، قم بإجراء ثلاث غسلات على الأقل. تُحضن البويضات في محلول M9 المنظم مع التحريك المستمر طوال الليل، مما يسمح بالفقس ولكنه يمنع المزيد من تطور الديدان. وعلى الرغم من أنه يمكن إجراء المزامنة عند أي درجة حرارة تتراوح بين 15 و25 درجة، إلا أنه يوصى بـ 15 درجة.

نظراً لأن عملية النمو تكون أبطأ، وكما ذكرنا أثناء تطورها، تمر دودة C. elegans بأربع مراحل يرقانية قبل بلوغ سن الرشد، وتعتمد هذه المدة على درجة الحرارة التي يتم تربيتها فيها. وفي حين تتحمل دودة C. elegans من النوع C درجات حرارة نمو تتراوح من 15 إلى 25 درجة، إلا أن معدل النمو يكون أعلى عند درجات الحرارة المرتفعة.

توضح درجة الحرارة المرتفعة هنا كيف تختلف مراحل نمو الديدان بعد مرور 24 ساعة. ففي درجتي 15 و25 درجة مئوية، نلاحظ بالفعل وجود أجنة بعد 48 ساعة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. ومع ذلك، يجب الانتظار لأكثر من 80 ساعة لرؤية الأجنة على سطح الأطباق.

للحصول على نتائج مثالية عند تربية الديدان في درجة حرارة 15 درجة، يجب مراعاة عدة مسائل عند إجراء تجربة التفتيت (blitzing). ومن المهم أيضاً التعرف على الديدان التي وصلت إلى المرحلة المطلوبة لإجراء التجربة. لذا، سنوضح لكم كيفية التمييز بين المراحل، سواء من خلال الحجم، أو مجهر التداخل التفاضلي، أو المجهر التبايني، أو عن طريق الصبغ.

في هذا الرسم البياني، يمكنك ملاحظة معدل نمو ديدان GaN وفقاً لدرجة الحرارة، حيث نجد أنها تنمو بشكل أسرع بكثير عند 25 درجة. هناك ارتباط بين حجم الحيوان وتطوره في العناصر البحرية. وباستخدام البرنامج المناسب، يمكن قياس الحيوانات ثم تصنيفها وفقاً للحالة التطويرية المناسبة.

ومع ذلك، وفقاً لهذا الرسم البياني، يُعد الموقع مؤشراً عاماً للمراحل التنموية. ويمكن تحقيق تحديد أدق للمراحل من خلال مراقبة أجزاء من البحار، وهي تشريح يمكن استخدامه والتعرف عليه إما عن طريق مجهر تباين التداخل التفاضلي أو صبغ DPI. في مختبرنا، استخدمنا هذا البروتوكول لمزامنة الديدان لتجارب مختلفة مثل البيوض المجهرية في الصبغ الأحادي، والتصور الموضعي، وصبغ up is.

علاوة على ذلك، يساعدك هذا البروتوكول أيضاً على التخلص من التلوث. يُستخدم مجهر تباين التداخل التفاضلي أو مجهر nomar لتعزيز التباين. وفي العينات الشفافة غير المصبوغة، يتم تثبيت الحيوانات وهي حية على قاعدة من 2% Agros، ويمكن تحضير agros مسبقاً وتخزينها عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لاستخدامها عند الحاجة.

يمكن صهره والحفاظ عليه عند درجة حرارة 65 درجة. وبمجرد صهر agros، ضع بعض الشريط اللاصق على شريحة زجاجية وضعها على كلا جانبي شريحة ثالثة. خذ كمية من agros بحذر وضع قطرة منها على الشريحة التي لا تحتوي على شريط لاصق.

قم بتغطية الـ agros بشريحة أخرى توضع بشكل عرضي. وبمجرد أن يتصلب المسار، افصل بين الشريحتين عن طريق سحب إحداهما فوق الأخرى بعناية. ستلتصق الوسادة بإحدى الشريحتين.

أضف بعضاً من مادة Amazon على الوسادة لإبقاء الديدان ثابتة. اختر بعض الديدان تحت المجهر التشريحي وانقلها إلى قطرة lele، مع تجنب إتلاف المسار.

خذ شريحة غطاء وأضف بعض طلاء الأظافر إلى الحواف. ضع شريحة الغطاء بعناية فوق هذه الشريحة لمنع تكون الفقاعات. يمكن ملاحظة التحضير فوراً تحت المجهر. إحدى أسهل السمات في تشريح *C. elegans* هي الحويصلة.

على سبيل المثال، تتميز المرحلة الرابعة (L4) بوجود الخلايا العصبية التي تتخذ شكل شجرة عيد الميلاد. يمكن الحصول على معلومات مفصلة حول تشريح C. elegans خلال مراحل النمو من خلال الموقع www.orla.org. ويُعد صبغ Tapis إجراءً شائعاً لتحديد الخلايا الفردية.

يُعد التثبيت باستخدام النفق طريقة سريعة لتثبيت الديدان. ولإجراء صبغ DAPI، أضف أولاً قطرة من محلول M9 المنظم على سطح شريحة مجهرية. ثم التقط بعض الديدان مباشرة من الطبق وانقلها إلى قطرة M9.

تخلص من الفائض من M nine إما باستخدام ماصة أو بمنديل ورقي ناعم. أضف نفقاً للديدان. كرر العملية.

بمجرد جفاف القطرة الأولى، أضف بعض وسائط التثبيت التي تحتوي على API وoversleep قبل نقل التحضير إلى المجهر. يمكن ملاحظة تطور الـ go بسهولة في warm stent مع api.