إعداد عامل نمو الخلايا T من Splenocytes الجرذ

مرحبا ، أنا كريستين بيتون. أنا باحث مساعد في مختبر جورج تشين في قسم علم وظائف الأعضاء والفيزياء الحيوية بجامعة كاليفورنيا في إيرفين. وفي اليومين المقبلين ، سأوضح لكم كيفية تحضير TCGF ، والذي يرمز إلى عامل نمو الخلايا التائية.

لذلك بالنسبة لثقافة الخلايا اليومية لدينا ، عندما لا نحتاج إلى معرفة دقيقة بتكوين السيتوكينات في وسط الثقافة ، فإن ما نستخدمه هو عامل نمو الخلايا التائية ، وهو طافي S من ثقافة spl CY التي تحتوي على السيتوكينات المطلوبة لمساعدة الخلايا التائية على التوسع. لذا فإن الطريقة التي نعد بها TCGF هي عندما نقتل فئران لويس السليمة ، نأخذ طحالها ، ونحضر معلق خلية واحدة ، ونتخلص من خلايا الدم الحمراء عن طريق ذلك ، ثم الخلايا النووية الأحادية التي سنحفزها باستخدام الكرنفال المخادع في أ ، والذي سيحفز الخلايا التائية على إنتاج جميع السيتوكينات المطلوبة لنموها. لإنشاء TCGF ، نحتاج إلى تنشيط الخلايا.

لذا فإن الطريقة التي نفعل بها ذلك هي أننا سنضيف الليكتين كونفال في اختصار باسم الهالة A إلى مزرعة الخلايا. لذلك عندما نضيف conc في a إلى مزرعة الخلايا ، فإنه سوف يرتبط بمركب مستقبلات الخلايا التائية الغليكوزيلية ويرتبط بعدة مجمعات في نفس الوقت ، وسوف يفعل ما نسميه السد. لذلك سوف تتجمع ، وتصنع مجموعة من جميع المستقبلات على سطح الخلية وهذا سيؤدي إلى إشارة تنشيط في الخلايا الليمفاوية التائية.

لذلك بعد تنشيط الخلايا ، سوف تنفجر. لذلك سوف يتضخمون ثم يبدأون في إفراز السيتوكينات. لذلك اعتقدنا في الأصل أن TCGF كان بشكل أساسي إنترلوكين اثنين ، لكننا نعلم الآن أن الأمر ليس كذلك حقا.

كما أنه يحتوي على إنترفيرون جاما TNF و alpha وربما أيضا السيتوكينات بكميات صغيرة جدا ضرورية فقط للحفاظ على الخلايا على قيد الحياة بعد 48 ساعة في الثقافة ، أنتجت الخلايا جميع السيتوكينات التي نحتاجها. لذلك سنقوم بإزالة الخلايا وعندما نزيل الخلايا ولدينا فقط المادة الطافية ، لا يزال لدينا بعض المخروط الحر في snat. وستكون هذه مشكلة لأننا نريد حقا استخدام عامل نمو الخلايا التائية للحفاظ على نمو خطوط الخلايا التائية.

وإذا تركنا الكونفال في حالة حرة هناك، فسوف ينشط الخلايا عندما لا نريد أن يتم تفعيلها. لذا، للتغلب على هذه المشكلة، سنضيف كمية زائدة من السكر الذي سيرتبط بكل الخليط الحر في المادة. لذلك سيتم تعطيله تماما ولن يرتبط بمستقبلات الغليكوزيلات الأخرى على الخلايا عندما نضيف TCGF إلى المزرعة.

لذلك دعونا نبدأ. الخطوة الأولى لهذه التجربة هي إخراج الطحال من الفئران مباشرة بعد القتل الرحيم. هذا ما سأفعله على الفور باستخدام أدوات معقمة.

وبمجرد إخراج الطحال ، سأضعها في PBS مكملة بالمضادات الحيوية وكمضادات حيوية أستخدم البنسلين والستربتومايسين. لذلك دعونا نبدأ. لذلك أرش الجرذ بنسبة 70٪ من الإيثانول للتأكد من عدم وجود أي تلوث طويل لثقافتي.

ثم باستخدام أدواتي ، سأقوم بعمل قطع صغير في الجلد هنا. ثم أزيل طبقة من العضلات ويظهر الطحال هنا. لذلك آخذ ملاقط أخرى ، وأسحب الطحال برفق دون إتلافه.

أقوم بإزالة النسيج الضام المتصل مثل هذا. والآن لدي طحال. بالطبع ، أنا حريص جدا على عدم إتلاف أي شيء آخر داخل تجويف البطن لأن أي ضرر للأمعاء سيؤدي إلى تلوث فوري للطحال.

وبعد ذلك سأقوم بنقل الطحال إلى أنبوب يحتوي على PBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية. وهذا الأنبوب أحتفظ به على الجليد. حتى الآن حصدت الطحال من ثلاثة فئران.

لذلك نحن مستعدون للذهاب وإعداد معلق خلية واحدة من تلك الطحال. والآن بعد أن أصبح لدي الطحال ، أحضرتهم إلى مزرعة الأنسجة لإعداد معلق خلية واحدة منها باستخدام مدربي خلايا 70 ميكرون. لذلك سأحتاج إلى عدة أشياء لجعل الخلية المفردة معلقة من الطحال.

أحتاج إلى أدوات معقمة وزوج واحد من الملقط وزوج واحد من المقصات. ثم لدي مكبس حقنة معقمة بحجم ميل واحد في طبق بتري. سأضع طحالي في PBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية.

وفي طبق بتري آخر ، وضعت مصفاة خلايا 70 ميكرون في 10 ملليلتر من PBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية. لذا فإن الخطوة الأولى هي التأكد من نظافة الطحال لأنه كما ترون هنا ، لا تزال هناك قطع صغيرة من الأنسجة الملتحمة وسأقوم بإزالتها لأنها ستسد مصفاة الخلايا بسرعة كبيرة. لذلك ، قمت ببساطة بقطع ما لا أريده والتخلص منه في غطاء طبق بتري.

والآن أصبح طحالي نظيفا في الغالب ، لذلك سآخذ الطحال واحدا تلو الآخر ، وأضعه في مدرب الخلية وأقطعه إلى قطع صغيرة وأقوم بخلط الطحال الثلاثة. الخطوة التالية هي عمل تعليق خلية واحدة. لذلك بالطبع نظرا لأنني أريد كل شيء ، فأنا لا ألمس مدرب الخلية على الإطلاق وأستخدم مكبس حقنة معقمة بطول ميل واحد للضغط على قطع الطحال من خلال مدرب الخلية.

وكما ترون على السطح الخارجي لمدرب الخلية ، لدي تعليق خلية واحدة يتم إجراؤه. لذلك في المرة الأولى ، لا يزال لدي بعض القطع الصغيرة من الطحال ، لكنني سأقوم بالفعل بإخراج معلق الخلية الواحدة. لقد قمت بالفعل بنقله إلى أنبوب سعة 50 مل قمت بتخزينه على الجليد.

وسأقوم بإعادة ملء مصفاة الخلية الخاصة بي ب 10 مليل أخرى من PBS والمضادات الحيوية. لذلك أتناول 10 ميلل أخرى من PBS الخاص بي مع المضادات الحيوية تقريبا ، لا يجب أن تكون بدقة 10 دقائق ، نحن فقط نغتسل. أضعها في مصفاة الخلية ثم أستخدم نفس الإجراء.

أعود إلى مكبس المحقنة الخاص بي وأضغط من خلال ocid أكثر قليلا. لذلك بالطبع لن تحصل على كل شيء أبدا لأن هناك أنسجة ملتحمة وقطع صغيرة من الدهون لم أتمكن من إزالتها والتي ستبقى في مصفاة الخلية. ولكن يجب أن تحصل على غالبية الطحال لمصفاة الخلية.

ثم أكرر بالضبط ما فعلته سابقا. سأقوم بحصاد معلق الخلية المفردة وإضافته إلى نفس السن. الآن لا يوجد شيء تقريبا من الشاشة المتبقي في جهاز فحص الخلية وبرنامج PBS الذي يخرج أكثر وضوحا وسأقوم ببساطة بغسل مرة أخرى ويجب أن يكون لدينا معظم الخلايا الآن.

الآن لدي تعليق خلية واحدة من خلايا PLE وسأقوم بتدويرها ببساطة لتنسيقها. لذا فإن الغزل لمدة ثماني إلى 10 دقائق سيكون كافيا. لقد قمنا الآن بتدوير سيلات PLE الخاصة بنا ولدينا لوحة لطيفة.

لذا ما سأفعله هو التخلص من المادة الطافية وسأقوم بعد ذلك بالتخلص من خلايا الدم الحمراء. لذا سأقوم بتعليق الخلايا العضلية وسأذهب إلى كلوريد الأمونيوم. إذن، إنه محلول SU من نقطة 15 مولي كلوريد الأمونيوم، وسأستخدم خمسة ملليلتر لكل طحال.

وبما أن لدي ثلاثة طحال، سأستخدم 15 ملليلترا من كلوريد الأمونيوم وسأفعل ذلك على الجليد. لذلك تكمن كريات الدم الحمراء ، سأقوم بتثبيتها برفق لأعلى ولأسفل لمدة ثلاث دقائق. حسنا ، سنستخدم هذا الالتقاط مع التعرض العالي هنا.

لقد قمت الآن بتحليل الخلايا الكهربائية لمدة ثلاث دقائق. سأملأ الأنبوب الخاص بي ببرنامج تلفزيوني أو يمكنك استخدام وسيط أيضا. هذا لإعادة أسمولية المحلول إلى المعدل الطبيعي للخلايا.

وسأقوم بتدوير الخلايا كما فعلت سابقا لمدة ثماني إلى 10 دقائق لتكريبها. وبعد ذلك سأغسلها مرتين باستخدام نفس PBS مع المضادات الحيوية. لذلك نحن الآن نمتد إلى أسفل الخلايا بعد إزالة الخلايا الكهربائية ولا تقلق ، فنحن لا نحصل أبدا على إطلاق مائة بالمائة من الخلايا الكهربائية.

لذلك ستظل البليت حمراء ، لكن المادة الطافية ستكون أكثر وضوحا. والآن سأقوم بإفراغ المادة الطافية ، وكسر البليت ، وإضافة بعض PBS حتى 50 مل ، والدوران لأسفل وتكرار هذه الخطوة مرة أخرى حتى أحصل على غسلتين وبعد ذلك سأتمكن من عد. لقد غسلت الخلايا العضلية مرتين ثم قمت بتعليقها في وسط الثقافة وقمت بحسابها باستخدام مقياس الخلوي.

كما هو متوقع. من ثلاثة طحال حصلت على حوالي 600 مليون خلية ، وهو أمر متوقع لأن الطحال الواحد يعطينا عادة 200 إلى 250 مليون خلية. لذا ما سأفعله الآن هو أنني سأزرع خلاياي بمعدل 2 مليون لكل مطحنة في وسطي الذي تم استكماله بمصل 10٪ من كاليرة الجنينية.

وإلى هذا الوسيط سأضيف ميكروغرامين لكل مطحنة من المخروط A لتحفيز الخلايا. وبعد ذلك سأضع الخلايا في الحاضنة لمدة 48 ساعة. كانت الخلايا الآن في الحاضنة لمدة 48 ساعة وكما سأوضح لك ، فقد نمت بشكل جيد.

تحول الوسط إلى اللون البرتقالي. لذلك نحن الآن مستعدون لإنهاء تحضيرنا ل TCGF. كما تتذكر ، أضفت الكرنفال المخادع في تعليق خليتي لتنشيط الخلايا.

لذا فإن الكرنفال المخادع في أ هو الليكتين. سوف يربط السكريات على جميع مستقبلات الخلية التائية وسينشط كل هذه الخلايا بشكل مصطنع. المشكلة التي نواجهها الآن هي أنه لا يزال لدينا بعض الكرنفال المخادع في الطافي في الخلية S.

وبما أننا سنستخدم snat في مزارع الخلايا التائية الأخرى لتوسيع الخلايا ، فإننا لا نريد الكرنفال المخادع في الحاضر في تلك المزارع الخلوية. لذا للتخلص منه ، ما سأفعله هو أنني سأضيف فائضا من السكر الذي يخدع إليه في الروابط ، وهذا هو ميثيل ألفا د سيت موضح هنا. وسأضيف فائضا من هذا السكر ، وأذوبه تماما.

سيقوم بربط كل ما تبقى من البحرية المخروطة في أ وبمجرد الانتهاء من ذلك ، سأقوم بتصفية المواد الطافية الخلوية الخاصة بي معقمة وسأقوم بتجميد سوائل علي لاستخدامها في الأسابيع أو الأشهر القليلة المقبلة. لذلك دعونا نبدأ في هذه الخطوة الأخيرة. لذلك أقوم بإضافة المادة الطافية لزراعة الخلايا إلى أنابيب 50 مل لأتمكن من تدويرها للتخلص من الخلايا.

لذلك أنا ببساطة أملأ أكبر عدد ممكن من الأنابيب حسب الضرورة ولا أفعل ذلك في غطاء الثقافة ، يمكنني ذلك ، ولكن نظرا لأنني بحاجة إلى أي طريقة لتصفية الحل الخاص بي في النهاية لأنني أضيف السكر ، وهو ليس معقما ، فأنا ببساطة أفعل ذلك على المقعد. إنه أسهل. لقد صببت الآن كل خلاياي والمواد الطافية في أنابيب الصقر التي يبلغ طولها 50 ميلا.

لذلك سأحضرهم إلى جهاز الطرد المركزي وأدويرهم لمدة 10 دقائق تقريبا. والسبب الوحيد لتدويرها هو تكسير الخلايا حتى يكون لدي مواد طافية واضحة. لقد امتدت الخلايا الآن إلى أسفل ، لذا فإن المادة الطافية واضحة وهذا ما أردت جمعه.

لذلك سأقوم بجمع كل المادة الطافية في قارورة نظيفة مساحتها 150 سم مربع. وإلى هذه القارورة سأضيف السكر. لذلك بينما كانت الخلايا تدور لأسفل ، قمت بوزن ما يكفي من السكر لإضافة 15 ملليغرام لكل مل من المادة الطافية.

سأتركها تماما ، واتركها تذوب ، وبعد ذلك سأقوم بتصفية المادة الطافية المعقمة. والآن سأضيف السكر 15 ملليغرام لكل مل من المادة الطافية. أعيد الغطاء وبما أنني لا أعمل في ظروف معقمة ، فلا يهم ما إذا كان الطعام يدخل في الغطاء ، لذلك أخلط حتى يذوب السكر بالكامل.

يجب أن يكون ذلك سريعا جدا. نعم ، كل السكر مذاب الآن. لذلك كل ما علي فعله هو أن المرشح المعقم مطفي للطافية وبعد ذلك سأقوم بتقطيعه.

لذلك عادة ما أقوم بعمل 10 إلى 15 مل من الحصص التي أقوم بتخزينها عند 20 درجة تحت الصفر. يمكن تخزين الحصص من هذا القبيل لعدة أشهر. يمكنك أيضا تخزين TCGF في الثلاجة ، ولكن بعد ذلك سأستخدمه في غضون 10 إلى 15 يوما القادمة.

خلال اليومين الماضيين ، أوضحت لك كيفية تحضير عامل نمو الخلايا التائية ، وهذا المادة الطافية سهلة التحضير ورخيصة جدا للتحضير. لذلك نستخدمه كثيرا في المختبر للحفاظ على خطوط الخلايا التائية في الثقافة دون الحاجة إلى شراء كوكتيلات باهظة الثمن من السيتوكينات. حظا سعيدا مع تجاربك.