جيل من الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الفئران مخلد الخط الخلية البطانية باعتبارها

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على مستنبت متجانس من الخلايا البطانية الدماغية الخالدة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الأدمغة من الفئران حديثة الولادة والحصول على معلق من الخلايا المفردة. وتتمثل الخطوة الثانية في جعل هذه الخلايا خالدة باستخدام مستضد polyoma middle T.

بعد ذلك، تنمو الخلايا لمدة أربعة أسابيع تقريبًا حتى تتشكل طبقة أحادية متجانسة من الخلايا البطانية. وتتمثل الخطوة النهائية في توصيف الخط الخلوي الجديد باستخدام تقنيات مثل الصبغ المناعي، ولطخة ويسترن (Western blot)، و Q-Q-P-C-R. وتمتد تطبيقات هذه التقنية لتشمل علاج الاضطرابات الدماغية الالتهابية العصبية أو الإقفارية، حيث يمكن من خلالها تقييم العلاجات في المرحلة قبل السريرية واكتساب رؤى حول الفيزيولوجيا المرضية.

ستقوم الدكتورة إيلين سالفادور، وهي باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبري، بشرح الإجراء. بعد إزالة الدماغ من فأر حديث الولادة يتراوح عمره بين ثلاثة إلى خمسة أيام ونقله إلى طبق بتري يحتوي على المنظم A، يلزم توفير أدمغة من خمسة إلى 10 فئران لكل تحضير أثناء العمل داخل غطاء تدفق صفائحي. قم بإزالة المخيخ، وجذع الدماغ، والسحايا، وشظايا الشعيرات الدموية من كل دماغ.

بعد ذلك، انقُل المخيخ إلى طبق بتري ثانٍ يحتوي على المنظم A. استخدم مشرطاً معقماً لتقطيع المخيخ إلى قطع صغيرة، ثم استخدم ماصة سعة 10 milliliter لسحب ودفع النسيج والمنظم حتى تختفي كافة التكتلات. عند هذه النقطة، انقُل المعلق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter بعد إجراء طرد مركزي لنسيج الدماغ بسرعة 250 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من الطافي وأذب الراسب في 4.5 milliliters من المنظم A مع 1.5 milliliters من 0.75% weight per volume.

أضف إنزيم الكولاجيناز. قم بتحضين النسيج ومحلول الكولاجيناز لمدة 45 دقيقة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C مع التقليب من حين لآخر. وفي هذه الأثناء، قم بتجهيز أطباق زراعة الأنسجة عن طريق طلاء أربعة آبار من طبق يحتوي على 12 بئراً بمحلول معقم بتركيز 0.1 mg/mL.

يسمح الكولاجين وحمض الأسيتيك بتركيز 50 millimolar بالتصاق الكولاجين بجدران الآبار في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. وبمجرد انقضاء فترة الحضانة التي تستغرق 45 دقيقة، يتم إيقاف هضم أنسجة الدماغ بإضافة 15 milliliters من المنظم A، ثم يتم إعادة تعليق الراسب جيداً في هذا المحلول. بعد ذلك، يتم إجراء الطرد المركزي عند 250 ×g لمدة 10 دقائق والتخلص من الراشح.

بعد ذلك، لإزالة الميالين من التحضير، أضف 10 milliliters من محلول B, s, A, and PBS المعقم بتركيز 25% weight per volume إلى النسيج، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 1000 times G لمدة 20 minutes عند درجة حرارة four degrees Celsius. بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل العلوي بعناية، ثم أذب الراسب في 15 milliliters من buffer A وانقله إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 milliliter، ثم أعد الطرد المركزي بسرعة 250 times G لمدة five minutes في درجة حرارة الغرفة. وفي هذه الأثناء، اغسل الطبق المطلي بـ collagen four مرتين باستخدام PBS.

بعد الغسلة الثانية، اترك اثنين من الآبار فارغين وأضف 2 mL من وسط النمو إلى البئرين الآخرين. بعد التخلص من السائل الطافي، قم بإعادة تعليق كتلة الخلايا، التي تتكون أساساً من الخلايا البطانية، في 4 mL من وسط النمو الذي يحتوي على 4 µg/mL من puram mycin، ثم وزع 2 mL من معلق الخلايا في كل بئر من البئرين الفارغين المطلِيّين بالكولاجين؛ قم بالتحضين عند 37 °C لمدة 45 دقيقة لقتل الخلايا غير البطانية سريعة الالتصاق. بعد ذلك، اسحب وسط النمو من البئرين اللذين لا يحتويان على خلايا وتخلص منه.

بعد ذلك، قم بنقل الوسط الذي يحتوي على الخلايا غير الملتصقة، والذي يتضمن جزء الخلايا البطانية، إلى هذين البئرين. أعد ملء الآبار السابقة بـ 2 mL من وسط غذائي جديد. تحتوي هذه الآبار على أنواع أخرى من الخلايا مثل الخلايا الليفية والخلايا النجمية، ويمكن تنميتها بالتوازي واستخدامها لإجراء مقارنات للشكل المورفولوجي.

قم بتحضين الخلايا طوال الليل في حاضنة زراعة الأنسجة. وفي اليوم التالي، استبدل الوسط بوسط جديد لزراعة خلايا GPE neo fibroblasts، التي تفرز فيروساً ناقص التضاعف يحتوي على جين polyoma middle T oncogene في دوارق مطلية بالجيلاتين تحتوي على GPE neomed. يؤدي ترانسفكشن Polyoma medial T oncogene إلى منح الخلايا البطانية ميزة نمو مقارنة بالخلايا غير البطانية، مما يؤدي إلى تكوين طبقة أحادية متجانسة من الخلايا ذات شكل مورفولوجي بطاني. بعد أربعة إلى ستة أسابيع من الزراعة، علماً بأن خلايا GPE neo غير متوفرة تجارياً ويمكن الحصول عليها كمواد عامة مشتركة.

بعد زراعة خلايا GPE Neo Fiberblast لمدة 24 ساعة، يتم سحب 10 milliliters من الوسط الغذائي وإضافة محلول poly brain المعقم للوصول إلى تركيز نهائي قدره ثمانية micrograms per milliliter. يتم تمرير خليط السائل الطافي عبر مرشح بمسامية 0.45 micron لإزالة أي شظايا خلوية. الآن، يتم سحب الوسط الغذائي من مستنبتات الخلايا البطانية وإضافة 2 milliliters من خليط السائل الطافي الذي يحتوي على poly brain إلى الآبار، ثم تُحضن الخلايا طوال الليل.

كرر هذا الإجراء في اليوم التالي باستخدام حصة جديدة من مزيج السائل الطافي للدماغ المتعدد. قم بإزالة مزيج السائل الطافي للدماغ المتعدد. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ثم أضف وسط نمو جديد.

استمر في تغيير وسط النمو كل ثلاثة أيام، وعندما تصبح الخلايا متلاحمة، قم بنقل الخلايا من مرة إلى مرتين إلى أطباق مغطاة بالكولاجين الرابع. وعادة ما يتم الحصول على خطوط خلوية مستقرة للخلايا البطانية الدماغية بعد أربعة إلى خمسة أسابيع من الزرع المتتالي.

عندما تملأ طبقة أحادية متجانسة من الخلايا البطانية البئر بالكامل. وبمجرد الحصول على خطوط خلوية مستقرة، تُنقل الخلايا إلى دوارق زراعة أنسجة مغلفة بالكولاجين 4، وتُمرر الخلايا مرة واحدة أسبوعياً كحد أقصى باستخدام التريبسين، وذلك بإضافة 3 mL من trypsin EDTA والتحضين عند 37 °C لمدة تتراوح من 5 إلى 15 دقيقة حتى تتفكك الطبقة الخلوية. وبعد إضافة 5 mL من الوسط الغذائي، تُزرع الخلايا في الدوارق الجديدة مع تجنب تقسيم الخلايا بنسبة تزيد عن 1:4.

بمجرد توفر عدد كافٍ من الخلايا للحصول على دورق T 75 متراص، يمكن تحضير حصص مبردة من الخلايا لاستخدامها لاحقاً. وللقيام بذلك، يتم حصاد الخلايا باستخدام التربسين كما سبق، ثم تُوضع معلق الخلايا في جهاز الطرد المركزي بسرعة 250 ×g لمدة خمس دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة، يتم إعادة تعليق كتلة الخلايا في 6 مل من وسط التجميد، ثم تُنقل 1.5 مل من معلق الخلايا بواسطة الماصة إلى أربعة أنابيب تجميد.

ضع الأنابيب المبردة في حاوية تجميد Nalgene مملوءة بالإيزوبروبانول واحفظها لمدة يوم واحد عند درجة حرارة 80- °C. وأخيرًا، خزن الأنابيب المبردة تحت النيتروجين السائل. قم بإذابة الأنابيب المبردة التي تحتوي على الخلايا في حمام مائي، ثم انقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter يحتوي على 10 milliliters من وسط النمو.

يتم تدفئة الوسط مسبقاً إلى 37 °C، ثم تُطرد الأنبوبة مركزياً عند 250 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد سحب الوسط، يُعاد تعليق الراسب في حجم مناسب من وسط النمو. يُنقل معلق الخلايا إلى قارورة زراعة خلايا T 25 مطلية بالكولاجين الرابع باستخدام وسط نمو مدفأ مسبقاً.

يجب أن تكون كثافة الخلايا عند الزراعة 1 × 10⁴ خلية/مل على الأقل. يتم تغيير الوسط في اليوم التالي والاستمرار في تمرير الخلايا كما سبق عندما تصل الخلايا إلى مرحلة التلاقي بعد حوالي خمسة أيام، وعندما تصبح جاهزة، يتم زراعة الخلايا بالكثافة المطلوبة لتجاربك اللاحقة. تم توصيف خلايا C end عن طريق التلوين المناعي لعلامات الخلايا البطانية وحاجز الدم الدماغي.

تظهر هذه الصورة المورفولوجيا الخاصة بخلايا C and المصبوغة مناعياً لبروتين clain five. تمتلك خلايا C and مورفولوجيا مشابهة للمستنبتات الأولية لخلايا ECS الدماغية، مع طبقات أحادية من الخلايا المتطاولة والمتراصة التي أظهرت تثبيطاً للنمو. وعند بلوغ الالتحام الشبكي، عبّرت الخلايا عن مستويات يمكن اكتشافها من clain.

تم هنا صبغ خلايا C CN مناعياً باستخدام جسم مضاد لبروتين occludin. ونرى هنا تعبير بروتينات VE cadherin، والتي تتركز عند الوصلات بين الخلايا، وذلك أيضاً كما يظهر من خلال صبغ الفلورة المناعية. تم قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة باستخدام تجميعة تحتوي على أقطاب كهربائية لمرور التيار وقياس الجهد.

يمكن ملاحظة أن المقاومة الكهربائية عبر الظهارية لخلايا C end تزداد مع مرور الوقت في المزرعة بعد نموها، كما يظهر في هذا الشكل. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلوم العصبية لاستكشاف اضطرابات الأوعية الدموية الدماغية في نموذج الفئران.