Name: عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم في المختبر لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: تعلم عزل البروتينات الوليدة من الريبوسومات لتحديد مواقع التوقف الترجمي على الرنا المرسال باستخدام الترجمة الخلوية. هذه الطريقة تساعد الباحثين على فهم ديناميكيات تخليق البروتين.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الإنسان الحدود برنامج منح العلوم RGP0024.

1. الحمض النووي تحضير قالب والنسخ في المختبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استنساخ الجينات التي تهم تحت / و T7 أو على سبيل المثال SP6 المروج النسخي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفي المختبر والنسخ الخطي الحمض النووي قالب مع انزيم تقييد المناسبة قطع المصب من كودون وقف ORF و / أو مرنا نهاية 3 &#39;. يحتاج المرء للتحقق من الخطية كاملة من الحمض النووي البلازميد عن طريق تشغيل المنتج الهضم قيود على الكهربائي للهلام الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استخدام البلازميد خطي لفي رد فعل النسخ المختبر. ويمكن اختبار تركيز مختلفة من الحمض النووي لتحديد قالب الأمثل تركيز الحمض النووي المطلوب لنسخ في المختبر. عموما، مع Ambion في MEGAscript عالية الغلة كيت النسخ (Ambion / الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك)، 1 ميكروغرام الحمض النووي الخطي ينتج 40-60 ميكروغرام من مرنا. في النسخ المختبر ويتم ذلك بعد تعليمات الشركة الصانعة (Ambion / الحياة تكنولوجيز، وغراند الجزيرد، نيويورك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد النسخ في المختبر يتم تنقيته من مرنا من قبل هطول الأمطار كلوريد الليثيوم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (Ambion في MEGAscript النسخ عالية الغلة كيت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم التحقق من سلامة مزيد مرنا بواسطة الكهربائي عن المواد الهلامية أو الاغاروز الأكريلاميد. </li></ol> 2. ترجمة الخلايا في المختبر الحرة للترجمة في المختبر باستخدام R abbit R eticulocyte المحللة، RRL (Promega، ماديسون، ويسكونسن) اتبع الخطوات التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 100 ميكروليتر في تعليم المختبر التالية رد فعل الشركة المصنعة للترجمة. لفترة وجيزة، في المياه nuclease مجانا إضافة 2 ميكرولتر خليط من الأحماض الأمينية الميثيونين ناقص (1 ملم)، 10 وحدات من المانع ريبونوكلياز (إينفيتروجن / الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك)، و 20 μCi المشعة [S 35]، الميثيونين (Biomedicals النائب، سولون، أوهايو)، و 70 ميكرولتر من الأرنب بالشبكيات المحللة (Promega، ماديسون، ويسكونسن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عشررد فعل ه في درجة حرارة 30 مئوية لمدة 5 دقائق إلى ما قبل دافئ رد فعل الترجمة. إضافة 2 ميكروغرام من مرنا إلى رد فعل الترجمة واحتضان في درجة حرارة 30 مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف رد فعل عن طريق وضع رد فعل الترجمة على الجليد. </li></ol> 3. عزلة البروتينية الوليدة من رد الفعل في ترجمة المختبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعزل ببتيد الوليدة ملزمة لريبوسوم (polysome)، والطبقات رد فعل الترجمة على أعلى من 4.5 مل من الجلسرين 30٪ في 10 ملي درجة الحموضة عازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.6، يحتوي على 100 ​​بوكل ملم، 10 ملم MgCI 2، وطرد في ز X 100000 في الدوار-110 TLA (بيكمان كولتر، المؤتمر الوطني العراقي، بريا، كاليفورنيا) لمدة 1 ساعة على درجة مئوية 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكذلك طاف إزالة بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبيليه معلق polysomal البروتينية التي تحتوي على الوليدة في حجم صغير (10-15 ميكرولتر) من 1 ملم درجة الحموضة عازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك 7،6، التي تحتوي على 0.5 ملغ / مل ريبونوكلياز، (إينفيتروجن / الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك)، والمحتضنة لل 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في النظاملتعزيز التحلل من الرابطة استر ببتيديل-الحمض الريبي النووي النقال، يضاف هيدروكسيد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 10 مم، واصلت الحضانة ل30 دقيقة إضافية. </li></ol> سيكون رد فعل في المختبر ترجمة تجميعها دون مرنا، وأجرى في ظل نفس الظروف (تليها العزلة من الببتيدات الوليدة كما وصفت) بمثابة رقابية كبرى. قد تكون المعالجة من رد فعل الترجمة (s) مع بوروميسين قبل إخضاع استخراج إلى الطرد المركزي المتدرج الكثافة بمثابة رقابة إضافية. 4. حل ببتيد الوليدة على صفحة SDS تريس-tricine <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حل البروتينية معزولة الوليدة وتحليلها في تريس، tricine SDS-PAGE. يرجى ملاحظة أن كمية المواد المحملة على هلام سوف يعتمد على كفاءة من وضع العلامات من البروتين، والكفاءة في ترجمة البروتين والعديد من المعالم الأخرى. وينبغي تعديل كمية المواد المحملة تجريبيا للسماح للبيزتي التصور وفصل السلاسل الفردية ببتيد الوليدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يتم إصلاح المواد الهلامية الكهربائي، تجفف باستخدام هلام فراغ صباغ ويتعرضون للتصوير الإشعاع الذاتي. ويلاحظ توزيع البروتينية الوليدة باستخدام phosphoimaging. </li></ol> 5. ممثل النتائج وقد ترجم البقري غاما-B غلوبولين العدسة في المحللة بالشبكيات الأرنب، وكذلك في E. يتبع القولونية S30 استخراج نظم (Promega، ماديسون، ويسكونسن) من العزلة من سلاسل ببتيد الوليدة. الشكل 1 يصور الخطوات المتبعة في عزلة من السلاسل الريبوسوم الوليدة منضم. في هذه الدراسة كان الهدف هو اختبار، إذا تغيير البيئة من أي مرجع ترجمة tRNAs (المعروف في أن تكون مختلفة إلى حد كبير في الثدييات (RRL) وبروكاريوتيك الأنظمة (كولاي) وذلك بسبب الاختلافات في انحياز كودون بين الكائنات الحية) يمكن تغير حركة الريبوسوم على طول مرنا وتؤثر على توزيع المواقع وقفة ترجمة.يجب أن تتغير حركة الريبوسوم تؤدي إلى تغييرات في توزيع أحجام البروتينية وليدة تراكم خلال الترجمة، فضلا عن كثافة النسبية. الشدة النسبية للفرق تعكس فترة توقف. تم عزل والبروتينية الوليدة وحلها على 16.5٪ T، و 6٪ C-تريس tricine SDS PAGE (الشكل 2). غاما-B غلوبولين العدسة هو بروتين 20 كيلو دالتون. مراقبة البروتينية الناشئة من عدم مطابقة الأطوال وشدة في RRL وهاء. نظم القولونية يشير إلى أن حركة ريبوسوم على طول مرنا في هذين النظامين يلي ترجمة حركية مختلفة. على سبيل المثال، لاحظنا الفرقة بارز من 17.7 كيلو دالتون في E. كولاي المحللة وليس في نظام RRL، مما يوحي بأن هناك وقفة إضافية موقع متعدية في المنطقة 3&#39;نهاية من مرنا (ترميز C-محطة منطقة غاما غلوبولين العدسة B)، عندما يتم ترجمته في E. كولاي نظام. نلاحظ أن غاما-B غلوبولين العدسة المرافئ جنبا إلى جنب الارجنتين كودونات (AGG 153 و 154 AGA) التي هي متكررة في نظم الثدييات، ولكن من المعروف أن نادر للغاية، وترجم ببطء في E. القولونية. الببتيد رواية الوليدة تتراكم في E. فغالبا ما يكون السبب نظام القولونية (~ الشكل 17.7 كيلو دالتون 2.2) بواسطة الريبوسوم التوقف عند هذه الكودونات جنبا إلى جنب نادر. يرجى ملاحظة أنه يمكن ملاحظة وجود فرق في ظل غياب مرنا (الشكل 2.3)، وأنه علاج بوروميسين يزيل معظم السلاسل الوليدة من polysomes (الشكل 2.3). علاج لفترات طويلة مع بوروميسين (&gt; 15 دقيقة) يزيل كل السلاسل الوليدة (لا تظهر البيانات). هذا يؤكد أن المنتجات المرصودة ببتيد هي الريبوسوم السلاسل الناشئة المرتبطة بها، بدلا من mRNPs cosedimenting مع polysomes. كما ذكر أعلاه، كودون التحيز هو كائن حي، وكذلك الأنسجة محددة. على سبيل المثال ممثل وصفها هنا، يشير بوضوح إلى أن تغيير البيئة من أي مرجع ترجمة tRNAs / كودونويمكن أن تؤدي إلى انحياز الحركة غيرت من الريبوسوم على طول مرنا. من الواضح، أن هذه التقنية بسيطة لا تسمح سوى تحديد المواقع وقفة متعدية على طول مرنا، ولكن تسمح أيضا مقارنة السريع للمواقع وقفة الترجمة بين النظم المختلفة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig1.jpg" /> الشكل 1. التخطيطي لشرح الخطوات المتبعة في عزل الريبوسوم البروتينية متجهة الوليدة. البقري غاما-B غلوبولين العدسة ORF تسلسل (أزواج قاعدة 528) تم استنساخ المصب من T7 المروج في pBSKS +. لنسخ في المختبر والخطي قالب الحمض النووي عن طريق التعامل مع EcoRI. وقد استخدم قالب خطي لفي النسخ المختبر. ومن المسلم به T7 المروج في قالب الحمض النووي بواسطة بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 أن المحاضر المصب الجينات غلوبولين العدسة غاما-B. يتم تنقيته مرنا باستخدام طريقة ترسيب كلوريد الليثيوم. يتم استخدام تنقية مرنا للترجمة في المختبر. بعدحضانة، والطبقات رد فعل الترجمة على رأس حل الجلسرين 30٪ وطرد لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية في ز X 100،000 إلى عزل الريبوسوم البروتينية متجهة الوليدة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig2.jpg" /> الشكل 2. العزلة من الأبقار البروتينية غلوبولين العدسة غاما-B الوليدة في ترجمتها الأرنب بالشبكيات المحللة (RRL) وهاء. كولاي المحللة. كانت مختلطة 2 مرنا ميكروغرام في 100 ميكروليتر التي تحتوي على رد فعل RRL أو E. كولاي S30 استخراج نظام (Promega، ماديسون، ويسكونسن) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع 20 μCi [S 35]، الميثيونين وحضنت في درجة حرارة 30 مئوية لمدة 5 دقائق. حضانة التالي تم الطبقات رد فعل الترجمة على أعلى من 4.5 مل من الجلسرين 30٪ في 10 ملي درجة الحموضة عازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.6، يحتوي على 100 ​​بوكل ملم، 10 ملم MgCI 2، وطرد لمدة 1 ساعة على درجة مئوية 4 و 100000 ز X في 1-110 TLA الدوار (بيكمان كولتر، المؤتمر الوطني العراقي، بريا، كاليفورنيا). كانت معزولة polyribosome بيليه دورة الفتشوبspended في 20 ميكرولتر من 1 درجة الحموضة تريس، حمض الهيدروكلوريك 7،6 ملم، تحتوي على 0.5 ملغ / مل ريبونوكلياز (إينفيتروجن / الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك)، يليه العلاج مع هيدروكسيد الصوديوم (كما هو موضح في قسم البروتوكول). تم حل البروتينية الوليدة على 16.5٪ T، و 6٪ C-تريس Tricine هلام SDS PAGE. تم تجفيفها الجل ومعرضة للتصوير الإشعاع الذاتي. بعد التعرض تم مسحها ضوئيا باستخدام الماسح الضوئي الجل شركة جنرال الكتريك للرعاية الصحية في التصوير الاعصار. الشكل 2.1 يبين هلام مع البروتينية الوليدة عزل وحلها بعد ردود الفعل ترجمة ذلك في نظامين مختلفين (RRL وكولاي). الشكل 2.2 تم تحليل صورة هلام بواسطة كوانت TL .، v2005 البرمجيات وتستخدم هنا كمثال لاظهار أنه لا يمكن الوزن الجزيئي وشدة الوليدة البروتينية تتراكم في واحدة ونظامان تحليلها بسهولة ومقارنة الشكل 2.3 يبين مجموعتين من الضوابط: البروتينية الوليدة عزل وحلها على صفحة SDS بعد الترجمة تم تجميع ردود الفعلبدون / ومرنا أو بعد أن تم التعامل مع ردود الفعل مع ترجمة بوروميسين (5 دقائق، اضرب نهائي. 1 ملم) قبل أن تعرض له رد فعل على الطرد المركزي.

<ol><li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li>
<li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli%2C+Bacillus+subtilis%2C+Saccharomyces+cerevisiae%2C+Schizosaccharomyces+pombe%2C+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens%3B+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li>
<li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221(2006).</li>
<li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li>
<li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides%2C+evidence+for+pause+localization+sites%2C+and+a+cotranslational+protein-folding+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li>
<li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li>
<li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+translation+of+%CE%B3+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system%3A+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li>
<li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth%2C+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li>
<li>Thanaraj, T. A., Argos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-mediated+translational+pause+and+protein+domain+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization.</a> Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).</li>
<li>Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22silent%22+polymorphism+in+the+MDR1+gene+changes+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity.</a> Science. 315, 525-528 (2007).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498(2011).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

من أجل تحقيق النتائج استنساخه، ونوعية وتركيز المكونات المستخدمة في النسخ المختبر، وردود الفعل ترجمة حاسمة. في الدراسة الحالية فقد استخدمنا مجموعات المتاحة تجاريا والمقتطفات التي تقدم بيانات استنساخه للغاية، إذا ما تم تناوله بعناية. ومع ذلك، يمكن أن تكون مستعدة بالترجمة المختصة مقتطفات من خلية من خيار واحد، وإذا لزم الأمر. نوعية مرنا يمكن أن تؤثر على الترجمة، لذلك فإن من الأهمية القصوى لاختبار سلامة mRNAs قبل استخدامه في المختبر خلال الترجمة. <p class...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف / كيت </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 السامية كيت النسخ العائد </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز المانع </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> عبر [35 S] التسمية </td><td> النائب Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز-A </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12091 </td></tr><tr><td> أرنب نظام المحللة الخلايا الشبكية، وتعامل Nuclease </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> E. القولونية نظام استخراج S30 لقوالب الخطي </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> الطرد المركزي </td><td> بيكمان كولتر </td><td> أوبتيما تلكس منبذة فائقة </td></tr><tr><td> تخزين الفوسفور صورة الإشعاع الذاتيذ </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> اعصار 9410 تصوير الوضع المتغير </td></tr><tr><td> برنامج لتحليل ببتيد الوليدة </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> صورة كوانت TL، v2005 </td></tr></tbody></table>

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

معدل استطالة متعدية هي غير موحدة. مرنا هيكل الثانوي، واستخدام كودون ومرنا البروتينات المرتبطة بها قد تغير حركة الريبوسوم على رسالة للمراجعة انظر 1. ومع ذلك، وانه الآن من المتفق عليه على نطاق واسع أن استخدام مرادف كودون هو السبب الرئيسي للمنظمات غير موحدة معدلات استطالة متعدية 1. لا تستخدم الكودونات المترادفة مع تردد متطابقة. والتحيز موجود في استخدام الكودونات المترادفة مع بعض الكودونات المستخدمة بشكل متكرر أكثر من غيرها 2. كودون التحيز هو كائن حي، وكذلك الأنسجة محددة 2،3. وعلاوة على ذلك، وتواتر استخدام كودون يتناسب طرديا مع تركيزات tRNAs وما شابه ذلك 4. وبالتالي، فإن كودون المستخدمة بشكل متكرر وارتفاع عدد وافر من tRNAs المقابلة، وهو ما يعني كذلك أن ترجم كودون متكررة بشكل أسرع من واحد نادر. وبالتالي، سيكون مرنا في المناطق ثراء في كودونات نادر (مواقع وقفة المحتملة) كقاعدة تبطئ حركة الريبوسوم في المساءجنرال الكتريك وسبب تراكم الببتيد الوليدة من أحجام كل منها 5-8. هذه المواقع يمكن أن يكون لها تأثير وقفة وظيفي على تعبير البروتين، واستقرار مرنا وقابلة للطي البروتين للمراجعة انظر 9. في الواقع، تبين أن التخفيف من هذه المواقع وقفة يمكن أن يغير حركة الريبوسوم على مرنا، وبعد ذلك قد يؤثر على كفاءة المشارك متعدية طي البروتين (في الحي) 1،7،10،11. لفهم عملية طي البروتين في الجسم الحي، في الخلية، ويقترن ذلك في نهاية المطاف إلى عملية تخليق البروتين من الضروري أن تحصل على معلومات شاملة عن تأثير استخدام محتوى / الحمض الريبي النووي النقال كودون على حركة ريبوسوم على طول مرنا أثناء استطالة متعدية . نحن هنا وصف تقنية بسيطة والتي يمكن استخدامها لتحديد المواقع الرئيسية وقفة ترجمة لمرنا نظرا تترجم في نظم خالية من الخلايا المختلفة 6-8. ويستند هذا الإجراء على العزلة من accumulati البروتينية الوليدةنانوغرام في ريبوسوم خلال الترجمة في المختبر لمرنا الهدف. الأساس المنطقي هو أن في التردد المنخفض كودونات، الزيادة في وقت الإقامة للنتائج ريبوسوم في زيادة كميات الببتيدات الوليدة من أحجام المقابلة. في المختبر مرنا المحولة يستخدم لردود الفعل في المختبر متعدية في وجود الأحماض الأمينية المسمى بالإشعاع للسماح للكشف عن السلاسل الوليدة. من أجل عزل متجهة الوليدة الريبوسوم المجمعات ببتيد والطبقات رد فعل الترجمة على رأس حل الجلسرين بنسبة 30٪ تليها الطرد المركزي. يتم التعامل مع مزيد من البروتينية الوليدة في بيليه polysomal مع ريبونوكلياز ألف وحلها بواسطة SDS PAGE. ويمكن هذه التقنية المستخدمة المحتمل لأي بروتين ويسمح تحليل حركة الريبوسوم على طول مرنا والكشف عن مواقع وقفة كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة العوامل والظروف التي يمكن أن تغير حركة الريبوسوم، وبالتالي يحتمل أن يغير أيضا عشره وظيفة / التشكل من البروتين.

وصفت وهناك تقنية لتحديد المواقع وقفة متعدية على مرنا. ويستند هذا الإجراء على عزل البروتينية وليدة تراكم على ريبوسوم في المختبر خلال ترجمة لمرنا هدف، يليه تحليل حجم السلاسل الوليدة باستخدام هلام إستشراد يبدل طبيعة المكونات.

إن معدل الاستطالة الترجمية غير منتظم، حيث قد تؤدي البنية الثانوية للحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA)، واستخدام الكودونات، والبروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبوزي المرسال إلى تغيير حركة الريبوسوم على...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وتعيين مواقع التوقف الترجمي الرئيسية لـ mRNA تم ترجمته في نظام ترجمة خالٍ من الخلايا. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استنساخ الجين المستهدف تحت تحكم محفز نسخ T7. بعد ذلك، يتم نسخ mRNA وتنقيته.بعد ذلك، يتم إجراء الترجمة في المختبر (in vitro translation) بوجود mRNA وأحماض أمينية مشعة لوسم البروتين المُصنَّع والببتيدات المتعددة الناشئة. وأخيراً، يتم عزل البوليسومات باستخدام طرد مركزي بسرعات الترسيب، ثم تُفصل السلاسل الناشئة المعزولة عن طريق الفصل الكهربائي للهلام. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر ببتيدات متعددة ناشئة بأطوال مختلفة بواسطة Tristine SDS page والتصوير الشعاعي الذاتي، مما يشير إلى وجود مواقع توقف على طول mRNA المستهدف.تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرقنا الحالية، مثل مقايسة حماية النواة الكوكية الدقيقة (micro cocal nucleus protection assay)، في كونها بسيطة وسريعة وفعالة للغاية، كما أنها تتيح تحديد وتعيين مواقع الترجمة الرئيسية على طول أي MNA في نظام مخاطر خلوي معين. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على بعض الأسئلة الجوهرية في مجال الترجمة وطي البروتين الترجمي، مثل كيفية تأثير العوامل الصحية، كاستخدام المخروط، أو وفرة TNA، أو البنية الثانوية لـ mRNA، على حركية الترجمة. وعلاوة على ذلك، قد تساهم هذه الطريقة في تعزيز فهمنا للعلاقات بين حركية الترجمة والخطوات الرئيسية في مسار طي البروتين أثناء ترجمة الشفرة.تمتد آثار هذه التقنية نحو فهم عملية طي البروتين داخل الجسم الحي (in vivo)، والتي يُعتقد على نطاق واسع أنها تحدث بشكل متزامن مع عملية الترجمة على الريبوسوم، على الرغم من أن الدراسة الحالية تتضمن ترجمة خالية من الخلايا لبروتين gamma bicrystalline باستخدام مستخلص خلوي متاح تجاريًا. يمكن تطبيق هذه التقنية أيضًا لتحديد العناصر المحددة للترجمة (translational IDE) في أي بروتين محتمل باستخدام مستخلص قادر على الترجمة تم تحضيره من أي مصدر خلوي. وبشكل عام، قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في خطوتين رئيسيتين من البروتوكول.يتمثل الأمر الأول في تحديد الوقت الإجمالي المطلوب لإجراء تفاعل الترجمة، مما يضمن بقاء غالبية بولي ببتيدات nascent مرتبطة بالريبوسوم. أما الأمر الثاني فهو إيجاد نظام فصل مناسب لفصل غالبية بولي ببتيدات nascent، حيث يعتمد اختيار نظام الفصل على حجم البروتين قيد الدراسة. لقد راودتنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قررنا دراسة حركية الترجمة لجزيئات globin في منتصف الثمانينيات، وذلك فيما يتعلق بالنموذج المقترح لطي الترجمة COT لـ globin.لوحظ عدم انتظام ترجمة الجلوبين لأول مرة بواسطة PRO وMaurice في عام 1974 عند استخدام كروماتوغرافيا CLO ذات الإغلاق الحجمي لسلاسل NAS والجلوبين. ومع ذلك، لم يمتلك تحليلهم الدقة المطلوبة، حيث لاحظ Pro وmore أربعة مواقع قوة ترجمة رئيسية أثناء ترجمة الجلوبين. لاحقاً، سمح تحليلنا بالكشف عن حوالي 10 مواقع قوة إضافية وبناء نموذج مفصل لطي الجلوبين الترجمي. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث تتضمن التقنية الموصوفة هنا عزل البوليسوم وتحليل الببتيد المتعدد الناشئ باستخدام هلام Tri S Ds page.تعد كلتا هاتين الخطوتين ضروريتين للحصول على نتائج عالية الجودة وقابلة للتكرار. سيقوم طالب دراسات عليا من مختبر Myelo Sujata بتوضيح البروتوكول الخاص بالنسخ المختبري للحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA). ابدأ بجين مستهدف تم استنساخه تحت محفز T7 و/أو SP6، وباستخدام إنزيم قطع مناسب، قم بكسر خطية قالب DNA في اتجاه المصب من كودون التوقف و/أو الطرف '3 لـ mRNA.يتم إجراء الرحلان الكهربائي لهلام الأجاروز لعينة من الهضم التقييدي للتحقق من أن الـ DNA قد تم تحويله بالكامل إلى شكل خطي. بعد تحديد التركيز الأمثل لقالب الـ DNA، استخدم طقم نسخ لنقل الـ DNA إلى mRNA مخبرياً وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، استخدم ترسيب كلوريد الليثيوم لتنقية الـ mRNA.ثم استخدم الرحلان الكهربائي لهلام الأكريلاميد أو rhos للتحقق من نقاوته. قم بتحضير تفاعل ترجمة في المختبر بحجم 100 µL في ماء خالٍ من النيوكلياز عن طريق إضافة خليط من الأحماض الأمينية بتركيز 1 mM بدون ميثيونين، و10 وحدات من مثبط RNA، و20 micro curies من الميثيونين المشع 35 S، ومستخلص الخلايا الشبكية للأرنب. بعد ذلك، قم بتدفئة التفاعل مسبقاً عن طريق تحضينه عند 30 °C لمدة خمس دقائق.بعد ذلك، أضف 2 µg من mRNA وحضنه عند 30 °C لمدة خمس دقائق لإيقاف التفاعل، ثم وضعه على الثلج لعزل متعددات الببتيد الناشئة المرتبطة بالريبوسومات. ضع تفاعل الترجمة في طبقة فوق 4.5 mL من glycerol بتركيز 30% في tris HCL بتركيز pH 7.6 مع potassium chloride وmagnesium chloride باستخدام جهاز طرد مركزي بدوار TLA 110 عند 100,000 ×g لمدة ساعة واحدة عند 4 °C. بعد ذلك، قم بإزالة الطافي بعناية، ثم أعد تعليق الراسب البوليسومي الذي يحتوي على متعددات الببتيد الناشئة في حجم صغير من tris, HCL buffer بتركيز 1 mM وpH 7.6 يحتوي على 0.5 mg/mL من ribonuclease A، وحضنه لمدة 30 دقيقة عند 37 °C.لتعزيز التحلل المائي للببتيد، ورابطة TRNA Esther، أضف هيدروكسيد الصوديوم بتركيز نهائي قدره 10 millimolar إلى التفاعل واتركه في الحاضنة لمدة 30 دقيقة إضافية. قم بفصل متعدد الببتيد الناشئة باستخدام tris tri SDS page، ثم قم بتثبيت الهلامات وتجفيفها. أخضع الهلامات للتصوير الشعاعي الذاتي، يليه التصوير الفسفوري للكشف عن متعدد الببتيد الناشئة.يجب أن تؤدي حركة الريبوسوم المتغيرة الناتجة عن التغيرات في مجموعة tRNA إلى تغييرات في توزيع أحجام الببتيدات المتعددة الناشئة التي تتراكم أثناء عملية الترجمة، بالإضافة إلى شدتها النسبية التي تعكس مدة التوقف عند هذه النقطة. تم عزل الببتيدات المتعددة الناشئة لبروتين gamma B crystalline وفصلها باستخدام تقنية Tristine SDS page. وتشير الأطوال والشدات غير المتطابقة للببتيدات المتعددة في نظامي RRL و e coli إلى أن حركة الريبوسومات على طول mRNA في هذين النظامين تتبع حركية ترجمة مختلفة.على سبيل المثال، لاحظ الحزمة البارزة بوزن 17.7 kilodalton في محلل e coli والتي لا تظهر في نظام محلل خلايا الشبكية للأرانب. يحتوي Gamma B crystalline على كودونات أرجينين ترادفية تتكرر في الأنظمة الثديية، ولكن من المعروف أنها نادرة للغاية وتُترجم ببطء في e coli، مما يشير إلى أن هذه الحزمة ناتجة عن توقف الريبوسوم عند هذه الكودونات النادرة الترادفية كما هو موضح هنا.لا يمكن ملاحظة أي حزم في حالة غياب mRNA، كما أن المعالجة بـ pur mycin تزيل معظم السلاسل الناشئة من polysome. بالإضافة إلى ذلك، فإن المعالجة المطولة بـ pur mycin تزيل جميع السلاسل الناشئة، مما يؤكد أن نواتج البولي ببتيد الملحوظة هي سلاسل ناشئة مرتبطة بالريبوسوم وليست MRPs تترسب بشكل مشترك مع polysome. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون يوم إلى يومين. وتعتمد مدة الإجراء بشكل أساسي على مدة خطوة الطرد المركزي وخطوة الفصل الكهربائي لهلام الببتيد الناشئ.أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم إيقاف تفاعل الترجمة فوراً بعد انتهاء وقت الحضن. ولتجنب تحرر الببتيد المتعدد الناشئ من الريبوسوم، من الضروري جداً تجنب وصول أي RNAs في أي خطوة. إذ يمكن أن يؤثر تلوث RNAs على كفاءة الترجمة في المستخلص ويؤدي إلى تحرر الببتيد المتعدد الناشئ من الريبوسوم عند اتباع هذا الإجراء.كما يمكن اختبار أهداف أخرى بعد تطوير هذه التقنية، مثل تأثير البروتينات المرتبطة بـ mRNA على كفاءة حركة الريبوسوم على رسالة معينة. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال طي البروتين لاستكشاف دور توقف الترجمة الناتج عن وجود شفرات نادرة في طي البروتين الترجمي. كما استُخدمت هذه التقنية سابقاً لاختبار دور استبدالات kaon على حركة الريبوسوم على الرسالة وطي البروتين الترجمي.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد مواقع قوة الترجمة في mRNA المقدم عن طريق عزل الببتيد المتعدد nascent المرتبط بالريبوسوم. لا تنسَ أن العمل مع النظائر المشعة والأحماض الأمينية الموصومة، مثل A 35 methionine على سبيل المثال، يتطلب احتياطات خاصة ويجب مراعاتها دائمًا عند تنفيذ هذا الإجراء.

isolation-ribosome-bound-nascent-polypeptides-vitro-to-identify

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وعائقا رئيسيا أمام التحليلات الكيميائية الحيوية للريبوسوم تحتوي الوليدة ببتيديل - tRNAs تم بحضور ريبوسوم أخرى في نفس العينات ، ريبوسوم لم يشارك في الترجمة من تسلسل مرنا محددة يجري تحليلها. وضعنا منهجية بسيطة لتنقية ، حصرا ، على ريبوسوم تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال - ببتيديل الوليدة من الفائدة.

عزلة ريبوسوم ترجمة المتضمن ببتيديل - tRNAs للتحليلات الوظيفية والهيكلية

نحن هنا وصف الاسلوب الذي يستخدم الآن بشكل روتيني لعزل متجهة ستابلي الريبوسوم المجمعات سلسلة الوليدة (RNCs). هذه التقنية يستفيد من اكتشاف ان 17 حمض أميني طويل "تسلسل اعتقال" SecM يمكن وقف استطالة ترجمة في بروكاريوتيك...

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

هنا، نحن تصف طريقة لتحليل التغيرات في الشروع في ترجمة مرنا من خلايا حقيقية النواة في الاستجابة لنؤكد الظروف. ويستند هذا الأسلوب على سرعة الفصل في التدرجات السكروز من ترجمة ريبوسوم من ريبوسوم غير ترجمة.

تحليل ترجمة بدء أثناء حالة الإجهاد التي كتبها Polysome التنميط

يوضح هذا البروتوكول التعديلات الضرورية من polyribosome تجزئة من أجل دراسة translatome في الجسم الحي من عينات الجهاز العصبي المركزي. لأنها تتيح تقييم عالمي للترجمة والنسخ التنظيم من خلال العزلة ومقارنة الحمض النووي الريبي مجموع الكسور إلى الريبوسوم الحمض النووي الريبي ملزمة.

في الجسم الحي الاستجواب من النظام العصبي المركزي Translatome بواسطة Polyribosome تجزئة

ريبوسوم تلعب دورا محوريا في تخليق البروتين. Polyribosome (polysome) تجزئة من قبل السكروز التدرج الكثافة الطرد المركزي يسمح تقرير مباشر من الكفاءة ترجمة mRNAs والفردية على نطاق الجينوم واسعة. بالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة يمكن استخدامها لتحليل الكيمياء الحيوية من والريبوسوم عوامل المرتبطة polysome مثل المحرمين وجزيئات الإشارة.

Polysome تجزئة وتحليل الثدييات Translatomes على مقياس الجينوم على نطاق

قدرة الخلايا على التكيف مع الإجهاد أمر بالغ الأهمية لبقائها على قيد الحياة. يعد تنظيم ترجمة الرنا المرسال إحدى استراتيجيات التكيف هذه ، حيث تنص على التنظيم السريع للبروتين. هنا ، نقدم بروتوكول توصيف متعدد الجمرات موحد لتحديد mRNAs محددة يتم ترجمتها بشكل انتقائي في ظل ظروف الإجهاد.

تقييم الانتقائية مرنا الترجمة في خلايا الثدييات من قبل Polysome التنميط

هذه المخطوطة وصف أسلوب لتصور وتحديد الأحداث الترجمة المترجمة في المقصورات سوبسيلولار. يتطلب نظام تصوير [كنفوكل] أساسية والمواد الكاشفة النهج المقترح في هذه المخطوطة وهي سريعة وفعالة من حيث التكلفة.

الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

نحن نقدم تقنية لتحقيق الاستقرار السريع في المجمعات التحويلية (التمثيل الحيوي البروتيني) مع الفورمالديهايد المترابطة في الخميرة الحية وخلايا الثدييات. النهج يتيح تشريح وسيطة عابرة وديناميكية الحمض النووي الريبي: التفاعلات البروتين. يمكن استخدام المجمعات المترابطة في تطبيقات متعددة في المصب مثل طرق التنميط العميق المستندة إلى التسلسل ، والتنظير الدقيق ، وقياس الطيف الكتلي.

تثبيت سريع في Vivo وعزل المجمعات الترجمية من الخلايا Eukaryotic

تلعب التفاعلات الانتقالية المشتركة دورا حاسما في تعديلات السلسلة الوليدة واستهداف مسارات الطي والتجميع. هنا ، نصف التنميط الريبوسومي الانتقائي ، وهي طريقة للتحليل المباشر لهذه التفاعلات في الجسم الحي في نموذج حقيقيات النوى Saccharomyces cerevisiae.

التحديد العالمي لشبكات التفاعل الانتقالي المشترك عن طريق التنميط الريبوسومي الانتقائي

تقنية البيوتينيل المعززة بالإضاءة المحددة بالموقع الخاصة ب AviTag (ALIBi) هي طريقة جديدة مفعلة بصريا تم تطويرها لوضع وسم وتنقية تجمعات الخلايا الفرعية للريبوسومات لأغراض التسلسل اللاحق والتحليل البروتيومي.

عزل مجموعات الريبوسومات تحت الخلوية بناء على بيوتينيل معززة بموقع معين للببتيدات المؤتلفة، مقيدة بالإضاءة،

تعلم عزل البروتينات الوليدة من الريبوسومات لتحديد مواقع التوقف الترجمي على الرنا المرسال باستخدام الترجمة الخلوية. هذه الطريقة تساعد الباحثين على فهم ديناميكيات تخليق البروتين.

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم

استكشف المزيد من الفيديوهات