عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم في المختبر لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وتعيين مواقع توقف الترجمة الرئيسية لـ mRNA يتم ترجمته في نظام ترجمة خالٍ من الخلايا. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استنساخ الجين المستهدف تحت تحكم محفز نسخ T7. بعد ذلك، يتم نسخ mRNA وتنقيته.

بعد ذلك، يتم إجراء الترجمة في المختبر (in vitro) بوجود mRNA وأحماض أمينية مشعة لوسم البروتين المُصنّع والعديد الببتيدية الناشئة. وفي الختام، يتم عزل البوليسومات باستخدام طرد مركزي يعتمد على سرعة الترسيب، ثم يتم فصل السلاسل الناشئة المعزولة عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر العديد ببتيدية ناشئة بأطوال مختلفة من خلال تقنية Tristine SDS page والتصوير الشعاعي الذاتي، مما يشير إلى وجود مواقع توقف على طول mRNA المستهدف.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرقنا الحالية، مثل مقايسة حماية نواة الكوكال الدقيقة (micro cocal nucleus protection assay)، في كونها بسيطة وسريعة وفعالة للغاية، وتسمح بتحديد وتوصيف مواقع الترجمة الرئيسية على طول أي mRNA في نظام خلوي معين. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على بعض الأسئلة الجوهرية في مجال الترجمة وطي البروتينات الترجمي، مثل كيفية تأثير العوامل الخلوية، مثل استخدام الكودونات، ووفرة tRNA و/أو البنية الثانوية لـ mRNA، على حركية الترجمة. علاوة على ذلك، قد تساعد هذه الطريقة في تعزيز فهمنا للعلاقات بين حركية الترجمة والخطوات الأساسية في مسار طي البروتينات المترجمة.

تمتد آثار هذه التقنية نحو فهم عملية طي البروتين داخل الجسم الحي (in vivo)، والتي يُعتقد على نطاق واسع أنها تحدث بالتزامن مع الترجمة (co translationally) أثناء عملية الترجمة على الريبوسوم، على الرغم من أن الدراسة الحالية تتضمن ترجمة خالية من الخلايا لبروتين gamma bicrystalline باستخدام مستخلص خلوي متاح تجارياً. ويمكن تطبيق هذه التقنية أيضاً لتحديد العناصر ذات التأثير الترجمي (translational IDE) في أي بروتين تقريباً باستخدام مستخلص قادر على الترجمة تم تحضيره من أي مصدر خلوي. وبشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في خطوتين رئيسيتين من البروتوكول.

تتمثل الخطوة الأولى في تحديد الوقت الإجمالي المطلوب لإجراء تفاعل الترجمة، وذلك لضمان بقاء غالبية الببتيدات المتعددة الناشئة مرتبطة بالريبوسوم. أما الخطوة الثانية فهي إيجاد نظام تعديل (just system) مناسب لفصل غالبية الببتيدات المتعددة الناشئة، حيث يعتمد اختيار نظام التعديل على حجم البروتين قيد الدراسة. لقد تبلورت فكرة هذه الطريقة لدينا لأول مرة عندما قررنا دراسة حركية الترجمة لجزيئات الجلوبين في منتصف الثمانينيات، وذلك فيما يتعلق بالنموذج المقترح لطي الترجمة المشترك (COT) للجلوبين.

لوحظ عدم الانتظام في ترجمة الغلوبين لأول مرة من قبل PRO و Maurice في عام 1974 عند استخدام كروماتوغرافيا CLO ذات الإقصاء الحجمي لسلاسل NAS والغلوبين. ومع ذلك، لم يتسم تحليلهم بالدقة المطلوبة، حيث لاحظ Pro و more وجود أربعة مواقع رئيسية لقوة الترجمة أثناء ترجمة الغلوبين. لاحقاً، أتاح تحليلنا الكشف عن حوالي 10 مواقع قوة إضافية وبناء نموذج مفصل لطي الغلوبين الترجمي. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث تتضمن التقنية الموضحة هنا عزل البوليسوم وتحليل الببتيد المتعدد الناشئ باستخدام هلام Tri S Ds page.

تعد هاتان الخطوتان ضروريتين للحصول على نتائج عالية الجودة وقابلة للتكرار. سيقوم طالب دراسات عليا من مختبر Myelo Sujata بتوضيح البروتوكول الخاص بالنسخ المختبري للحمض النووي الريبوزي المرسال mRNA. ابدأ بجين مستهدف تم استنساخه تحت محفز T7 و/أو SP6، وباستخدام إنزيم قطع مناسب، قم بعملية خطية (linearize) لقالب DNA في منطقة تالية لكودون التوقف و/أو الطرف '3 لـ mRNA.

يتم إجراء تحليل لعينّة من الهضم التقييدي عبر الرحلان الكهربائي لهلام الأجاروز للتأكد من تحويل DNA إلى شكل خطي بالكامل. وبعد تحديد التركيز الأمثل لقالب DNA، تُستخدم مجموعة أدوات النسخ لإجراء عملية نسخ mRNA في المختبر وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، يتم تنقية mRNA باستخدام طريقة الترسيب بكلوريد الليثيوم.

بعد ذلك، استخدم الفصل الكهربائي للهلام سواء باستخدام الأكريلاميد أو agarose للتحقق من نقاوته. قم بتحضير تفاعل ترجمة في المختبر (in vitro translation) بحجم 100 µL في ماء خالٍ من النوكلياز عن طريق إضافة خليط أحماض أمينية بتركيز 1 mM بدون الميثيونين، و 10 وحدات من مثبط RNA، و 20 µCi من الميثيونين المشع 35 S، ومحلول الشبكية للأرانب (rabbit reticulocyte lysate). بعد ذلك، قم بتدفئة التفاعل مسبقاً عن طريق حضنه عند 30 °C لمدة خمس دقائق.

ثم أضف 2 µg من mRNA وقم بالتحضين عند 30 °C لمدة خمس دقائق لإيقاف التفاعل، ثم ضعه على الثلج لعزل عديدات الببتيد الناشئة المرتبطة بالريبوسومات. ضع تفاعل الترجمة فوق 4.5 mL من 30% glycerol في محلول tris HCL بـ pH 7.6 يحتوي على potassium chloride و magnesium chloride، باستخدام جهاز طرد مركزي بدوار TLA 110 عند 100,000 ×g لمدة ساعة واحدة عند 4 °C. بعد ذلك، قم بإزالة السائل الطافي بعناية، ثم أعد تعليق كتلة البوليسوم التي تحتوي على عديدات الببتيد الناشئة في حجم صغير من محلول tris HCL المنظم بتركيز 1 mM و pH 7.6 يحتوي على 0.5 mg/mL من ribonuclease A، وقم بالتحضين لمدة 30 دقيقة عند 37 °C.

لتعزيز التحلل المائي للببتيد، ورابطة TRNA Esther، أضف هيدروكسيد الصوديوم بتركيز نهائي قدره 10 millimolar إلى التفاعل واتركه في الحاضنة لمدة 30 دقيقة إضافية. افصل الببتيدات المتعددة الناشئة باستخدام tris tri SDS page، ثم قم بتثبيت الهلامات وتجفيفها. أخضع الهلامات للتصوير الشعاعي الذاتي، يليه التصوير الفسفوري للكشف عن الببتيدات المتعددة الناشئة.

ينبغي أن تؤدي حركة الريبوسومات المتغيرة الناتجة عن التغيرات في مخزون TRNA إلى تغيرات في توزيع أحجام الببتيدات المتعددة الناشئة التي تتراكم أثناء عملية الترجمة، بالإضافة إلى شدتها النسبية، والتي تعكس مدة التوقف في هذه النقطة. تم عزل الببتيدات المتعددة الناشئة لبروتين gamma B crystalline وفصلها باستخدام تقنية Tristine SDS page. وتُشير الأطوال والشدات غير المتطابقة للببتيدات المتعددة في نظامي RRL و e coli إلى أن حركة الريبوسومات على طول mRNA في هذين النظامين تتبع حركية ترجمة مختلفة.

على سبيل المثال، لاحظ الحزمة البارزة بوزن 17.7 kilodalton في محلل e coli والتي لا تظهر في نظام محلل الخلايا الشبكية للأرانب. يحتوي Gamma B crystalline على كودونات أرجينين متتالية شائعة في الأنظمة الثديية، ولكن من المعروف أنها نادرة للغاية وتُترجم ببطء في e coli، مما يشير إلى أن هذه الحزمة ناتجة عن توقف الريبوسوم عند هذه الكودونات النادرة المتتالية كما هو موضح هنا.

لا يمكن ملاحظة أي حزم في حالة غياب mRNA، كما أن المعالجة بالـ pur mycin تزيل معظم السلاسل الناشئة من البوليسوم. بالإضافة إلى ذلك، تؤدي المعالجة المطولة بالـ pur mycin إلى إزالة جميع السلاسل الناشئة، مما يؤكد أن نواتج البوليببتيد المرصودة هي سلاسل ناشئة مرتبطة بالريبوسوم وليست بروتينات MRPs تترسب بشكل مشترك مع البوليسوم. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون يوم إلى يومين، حيث تعتمد مدة الإجراء بشكل أساسي على مدة خطوة الطرد المركزي وخطوة الفصل الكهربائي لهلام الببتيدات الناشئة.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم إيقاف تفاعل الترجمة فور انتهاء وقت التحضين. ولتجنب تحرر الببتيد المتعدد الناشئ من الريبوسوم، من الضروري للغاية تجنب وجود الـ RNAs في أي خطوة. حيث يمكن أن يؤثر تلوث الـ RNAs على كفاءة الترجمة في المستخلص ويؤدي إلى تحرر الببتيد المتعدد الناشئ من الريبوسوم عند اتباع هذا الإجراء.

يمكن أيضاً اختبار أهداف أخرى، مثل تأثيرات البروتينات المرتبطة بـ mRNA على كفاءة حركة الريبوسوم على رسالة معينة بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال طي البروتين لاستكشاف دور توقف الترجمة الناتج عن وجود شفرات نادرة في طي البروتين الترجمي. كما استُخدمت هذه التقنية سابقاً لاختبار دور استبدالات kaon على حركة الريبوسوم على الرسالة وطي البروتين الترجمي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد مواقع الترجمة في mRNA المعروض من خلال عزل الببتيد المتعدد nascent المرتبط بالريبوسوم. لا تنسَ أن العمل مع النظائر المشعة والأحماض الأمينية الموُسمة، مثل methionine-35 على سبيل المثال، يتطلب احتياطات خاصة ويجب مراعاتها دائمًا عند تنفيذ هذا الإجراء.