باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل SEC TED 70 s المرتبطة بالريبوسوم ، مجمعات السلسلة الوليدة أو RNCs التي يتم إنتاجها أثناء الترجمة في نظام خال من الخلايا في المختبر. يتم تحقيق ذلك من خلال إدخال تسلسل توقف SEC M طويل من 17 حمضا أمينيا أولا إلى الطرف الطرفي C للجين محل الاهتمام واستنساخه في اتجاه مجرى مروج النسخ T السبعة. بعد ذلك ، يتم نسخ mRNA باستخدام تفاعل النسخ في المختبر ثم تنقيته.

ثم تتم ترجمة الرنا المرسال المنقى في نظام استخراج القولونية S 30 E مع الأحماض الأمينية المشعة لتسمية البروتين المركب أو عديد الببتيد الناشئ. أخيرا ، يتم عزل مجمعات السلسلة الوليدة الثانية المرتبطة بالريبوسوم السيد إد عن طريق السكروز والتدرج والطرد المركزي والتجزئة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح أن السلاسل الناشئة مرتبطة بثبات بالريبوسوم 70 ثانية عن طريق تحليل الرحلان الكهربائي الهلامي لعديد الببتيدات المسمى المعزولة من الكسور المتدرجة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل استخدام mRNA الذي يفتقر إلى كودون المخزون هو أنه يضمن بكفاءة عالية ربط سلسلة عديد الببتيد الوليدة بالريبوسوم 70 ثانية أثناء الترجمة وخطوة الطرد المركزي اللاحقة. بالإضافة إلى ذلك ، على عكس تقنية الطوق بدون توقف ، يمكن استخدام هذه الطريقة بكفاءة متساوية تقريبا خلال كل من نظام المختبر وفي الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال طي البروتين الانتقالي ، مثل الكيفية المبكرة التي قد تتشكل فيها العديد من المواد الوسيطة القابلة للطي أثناء الترجمة وتساعد بشكل أكبر في تحليل هيكلها باستخدام بنية مباشرة أو غير مباشرة.

مناهج التحقيق والتحديد يمكن أن تساعدنا هذه التقنية في فك تشفير مسار طي البروتين على الريبوسوم. في هذا البروتوكول ، وصفنا عزل سلاسل البلورية الوليدة البلورية بطول 70 ثانية مرتبطة بالريبوسوم. ولكن يمكن استخدام هذه التقنية لعزل الأمراض المتنوعة لأي بروتين ذي أهمية تقريبا.

يمكن أيضا اعتماد هذه الاستراتيجية لعزل سلاسل بولي ببتيد ناتين المقطوعة من الجلد Es.Tعموما ، قد يكافح الفرد الجديد في هذه الطريقة أثناء خطوة الطرد المركزي المتدرج للسكروز. ومع ذلك ، بالنسبة للتجربة الأولى ، لا ينبغي أن تكون هذه مشكلة. قررنا استخدام تسلسل المماطلة الثاني لعزل عديد الببتيدات الوليدة البلورية جاما ب المرتبطة ب 70 كريبوسوم بعد محاولات أولية أقل نجاحا تضمنت استخدام mRNA الذي يفتقر إلى التوقيق.

لم تستطع التقنية اللاحقة ضمان استقرار RNCs أثناء خطوات الطرد المركزي اللاحقة بنفس كفاءة التقنية التي تنطوي على استخدام تسلسل توقف SECM. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث قد يكون من الصعب تعلم الخطوات التي تنطوي على إعداد التدرج وفصل RNC ويتطلب مستوى معينا من الخبرة لضمان نتائج قابلة للتكرار ، وسيكون إظهار الموقف طالب دراسات عليا من مختبري لإجراء النسخ والترجمة في المختبر. ابدأ بجين ذي أهمية يتم استنساخه في أي بلازميد قائم على T سبعة و أو SP ستة لتوليد مجمعات سلسلة ريبوسوم الوليدة أو RNCs.

قم بتمديد الطرف C لعديد الببتيد المستهدف عن طريق إضافة التسلسل المحفز للتوقف من M للتأكد من أن جزء عديد الببتيد سوف ينبثق من النفق الريبوسومي. أضف رابطا مرنا غني بالجليسين السوري بين البروتين وتسلسل إيقاف SEC M للتحضير للنسخ في المختبر ، وإنزيم تقييد المستخدم الذي سيقطع اتجاه مجرى إطار القراءة المفتوح لخطية قالب الحمض النووي الذي يقوم بتشغيل الرحلان الكهربائي للهلام AROS للتحقق من الهضم الكامل للعينة. بعد التحقق من تركيز الحمض النووي الأمثل ، استخدم مجموعة نسخ عالية الإنتاجية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لتصنيع الحمض النووي الريبي المرسال.

استخدم ترسيب كلوريد الليثيوم لتنقية الرنا المرسال. ثم قم بتشغيل عينة على مادة الأكريلاميد أو هلام aros للتحقق من نقائها. للترجمة في المختبر.

باستخدام نظام الإشريكية القولونية في الماء الخالي من النوكلياز ، أضف خليط من الأحماض الأمينية المليمولية مطروحا منه الميثيونين 10 وحدات من مثبط الريبونوكلياز 20 ، والكوري الدقيق من 35 ثانية من الميثيونين ، و 20 ميكرولتر من مزيج التفاعل ، و 24 ميكرولتر من محلول إعادة التكوين و 24 ميكرولتر من الإشريكية القولونية. المحلل. قم بتسخين التفاعل عن طريق احتضانه عند 30 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم أضف ميكروغراما إلى ميكروغرامين من الرنا المرسال واحتضنه لمدة 10 إلى 15 دقيقة إضافية عند 30 درجة مئوية.

أوقف التفاعل عن طريق وضعه على الجليد لعزل مجمعات السلسلة الوليدة المرتبطة بالريبوسوم أو ncs بمقدار 70 ثانية. ضع طبقة من تفاعل الترجمة فوق 4.5 ملليلتر من تدرج سكروز من خمسة إلى 30٪ في أكوام 20 ملليمول. هيدروكسيد البوتاسيوم الرقم الهيدروجيني 7.5 15 مللي مولار المغنيسيوم ، 100 مللي مولار أسيتات البوتاسيوم ، وجهاز طرد مركزي DTT واحد مليمولار عند 41 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية بعد الطرد المركزي ، قم بتجزئة تدرج السكروز باستخدام نظام تدرج كثافة قابل للبرمجة وكاشف امتصاص تم ضبطه عند 254 نانومتر.

اجمع الكسور التي تحتوي على 70 ثانية ريبوسومات لمزيد من التحليل لتحديد ما إذا كان البروتين الممتد SEC M لا يزال مرتبطا بالريبوسوم 70 ثانية. قم بترسيب البروتين في كل جزء متدرج عن طريق إضافة حمض ثلاثي كلورو أسيتيك. احتضان العينات بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي ، وقم بالطرد المركزي للعينات عند 14 ، 000 مرة G لمدة 15 دقيقة لحبيبات البروتين ، وغسل الكريات بنسبة أربعة إلى واحد من الأسيتون إلى واحد مليمولار ، حمض هيدروكلوريك 7.6.

جفف الكريات في الهواء ، ثم أعد تعليقها في المخزن المؤقت لتحميل صفحة SDS. قم بحل العينات عن طريق صفحة tris Trice SDS ، ثم قم بإصلاح المواد الهلامية وتجفيفها وإخضاعها للتصوير الشعاعي التلقائي والتصوير الفوسفو كما هو موضح هنا. بعد الترجمة في المختبر ، تم عزل الريبوسومات 70 S عن طريق السكروز والتدرج والطرد المركزي والتجزئة لضمان بقاء بروتين جاما ب البلوري مرتبطا بثبات بالريبوسوم.

تم تجميع الكسور المحتوية على 70 ثانية ، وتبادل عازلة محلية ، وإخضاعها لجولة إضافية من الطرد المركزي المتدرج للسكروز. تشير النتائج المعروضة هنا إلى أن SEC M يمكن أن تحفز بكفاءة التوقف الانتقالي ل RNCs البلورية جاما B. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن إجراؤها في يوم عمل واحد باستثناء تحليل الرحلان الكهربائي للهلام للسلسلة الوليدة ، والذي يتضمن عادة خطوة ترسيب TCA بين عشية وضحاها.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من الواضح أنه من الأهمية بمكان تجنب تلوث الحمض النووي الريبي بأي خطوات. قد يؤثر تلوث RNS على الكفاءة الانتقالية للمستخلص ويؤدي إلى إطلاق عديد الببتيد الناشئ من الريبوسوم 70. باتباع هذا الإجراء ، يمكن للمرء الحصول على NAST وعديد الببتيدات من اللانكس المحدد مسبقا المرتبط بثبات بالريبوسوم 70 اعتمادا على الهدف النهائي.

يمكن استخدام هذه المجمعات لأغراض مختلفة مثل تحديد تأكيد السلاسل الوليدة المرتبطة بالريبوسوم باستخدام مناهج مباشرة وغير مباشرة مثل الرنين المغناطيسي النووي أو فري ، أو عامل الاختبار وربط الترابط بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا الهيكلية وطي البروتين لاستكشاف تأكيد البروتينات كاملة الطول المرتبطة بالريبوسوم ، بالإضافة إلى المواد الوسيطة القابلة للطي الانتقالية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير وعزل عديد الببتيد الناشئ ، المرتبط بثبات بالريبوسوم 70 ثانية ، والذي يمكن استخدامه بشكل أكبر للإجابة على أسئلة مختلفة في مجال طي البروتين الانتقالي.

لا تنس أن العمل مع النظائر المشعة وأحماض الأمين المسماة ، مثل ، على سبيل المثال ، A 35 ميثيونين يتطلب احتياطات خاصة ويجب أن يؤخذ دائما في الاعتبار أثناء تنفيذ هذا الإجراء.