تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

خيط ليكو سلبي ، فيروسات الحمض النووي الريبي. يتم تعبئة جينوم فيروسات الأنفلونزا في شكل مجمعات بروتين نووي أضلاع فيروسية ، أو VR nps حيث يتم تغليف الجينوم الفردي الذي تقطعت به السبل بواسطة البروتين النووي ويرتبط بمركب بوليميراز الكركم الذي يتكون من وحدتين فرعيتين PA PB one و PB لتنقية المجمعات السليمة من خلايا الثدييات المصابة. يتم تحضين خلايا هيلا بفيروس الأنفلونزا العقدي المؤتلف.

بمجرد دخول الفيروس إلى الخلايا ، يتم تصنيع الحمض النووي الريبي الفيروسي في النوى بعد الإصابة ، وتكذب الخلايا في استخدام منظف ويتم تقسيمها إلى كسور نووية وكروماتين سيتوبلازمية باستخدام الطرد المركزي وبروتوكول كسر الكروماتين القائم على الهجوم. أخيرا ، فإن VRPs الموسومة بالسترابت هي تقارب يتم تنقية من كل تحليل جزء من تكوين البروتين والحمض النووي الريبي ل VR NPS المنقى عن طريق تلطيخ الفضة يوضح أنه باستخدام هذا البروتوكول حتى بإحكام ، يمكن عزل VRPs المرتبطة بالكروماتين. سالم. لذا فإن إحدى المزايا الرئيسية لبروتوكولنا عند مقارنتها بالطرق القياسية لمجمعات البروتين النووي لفيروس الأنفلونزا لتنقية التقارب هي أنه باستخدام طريقتنا ، من الممكن تنقية VR NPS من كروماتين الخلايا المصابة ، والذي يعرف بأنه موقع تخليق mRNA لفيروس الأنفلونزا.

لذلك يمكن استخدام طريقتنا للإجابة على الأسئلة المحيطة بتنظيم تكاثر الفيروس والنسخ ، مثل ، على سبيل المثال ، العوامل الفيروسية أو الخلوية ، ولكن أيضا التعديلات اللاحقة للترجمة المطلوبة ، على سبيل المثال ، تخليق mRNA الفيروسي أو أيضا تخليق الحمض النووي الريبي الجيني الفيروسي. لذلك قد يواجه الباحثون الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبة لأن التجزئة النووية الفرعية حساسة جدا للظروف الكيميائية الحيوية ويمكن أن تختلف أيضا اختلافا كبيرا بين خطوط الخلايا المختلفة. ابدأ هذا البروتوكول بشفاء خلايانا المصابة بفيروس الأنفلونزا ، RWSN PB اثنين من البكتيريا العقدية ، والتي تحتوي على علامة عقدية مدمجة وراثيا في الطرف C من الوحدة الفرعية PB الثانية في تعدد العدوى ثلاثة.

اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS البارد ، ثم أضف 12 مل من PBS البارد وقم بإزالتها من الطبق. باستخدام مكشطة مطاطية. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وقم بحبيبها عن طريق الطرد المركزي.

أصعب جانب في هذا الإجراء هو بروتوكول تجزئة الخلايا. نوى الخلية حساسة جدا لإجراءات التجانس والخلط ، وإذا تم إجراؤها بشكل غير صحيح ، فيمكن أن تدمر بسهولة مستخلص الكروماتين. لذلك من المهم جدا اتباع ليس فقط تقنيات التجانس ، ولكن أيضا التعامل العام مع المحللات كما نوضح هنا.

بعد شفط الدوران ، يقوم PBS و Resus بتعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من السكروز البارد. قم بتوصيل طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر بماصة مصل بلاستيكية سعة 10 ملليلتر وقم بتمرير الخلايا من خلالها لتفتيت كتل الخلايا. احتضن المعلق على الجليد لمدة 10 دقائق.

الخلايا بشكل دوري برفق لتعليقها. بعد ذلك ، أضف غير IET P 40 إلى التركيز النهائي البالغ 0.5٪ والدوامة بسرعة عالية لمدة 15 ثانية على الفور لمدة 10 دقائق عند 3 ، 500 مرة G عند أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي منضدي. بعد الدوران ، قم بإزالة supinate ونقله إلى 15 مل إلى أنبوب مخروطي الشكل.

قم بتخزين supinate عند أربع درجات مئوية. هذا جزء سيتوبلازمي. يجب أن تكون الحبيبات أصغر وأكثر بياضا من حبيبات الخلية الأصلية كما هو موضح هنا.

إذا تم الانتهاء من البروتوكول في وقت لاحق ، فقم بتخزين حبيبات الخلية عند أربع درجات مئوية. خلاف ذلك ، استمر في غسل الحبيبات في خمسة ملليلتر من السكروز البارد ، والمخزن المؤقت ، والطرد المركزي كما كان من قبل. بمجرد اكتمال الدوران ، تخلص من الحبيبات وأعد تعليقها ، والتي تحتوي على النوى في 1.5 مل من المخزن المؤقت لاستخراج البلازما النووي البارد.

انقل الحبيبات المعلقة إلى خالط رقص زجاجي مبرد بالكامل بسعة أربعة ملليلتر باستخدام مدقة محكمة وقم بتجانس النوى ب 20 ضربة. تجنب الرغوة ، يجب أن تزداد المقاومة بعد حوالي 10 ضربات. للتأكد من التجانس الفعال ، افحص العينة تحت مجهر تباين الطور.

يجب ألا تكون النوى مستديرة بعد الآن ، ولكن لها أشكال غير منتظمة وتبدو كما لو أنها قد انفجرت. بمجرد تجانس النوى ، انقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. احتضان التجانس على عجلة دوارة عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

ثم جهاز الطرد المركزي عند 16،000 مرة G في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، انقل السوبينات ، وهو الجزء البلازمي النووي إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر ، وقم بتخزينه عند أربع درجات مئوية. ثم يقوم ريس بتعليق الحبيبات في 1.5 مل من الهضم ، وقم بتسخين الدرجة الأولى إلى 37 درجة مئوية.

ثم احتضن الكسر لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 42 ميكرولترا من خمسة كلوريد صوديوم مولار ليصل التركيز النهائي لكلوريد الصوديوم إلى 150 مليمولار ثم احتضانه لمدة 20 دقيقة على الجليد. جهاز طرد مركزي عند 16 ، 000 مرة ، G في جهاز طرد مركزي صغير بأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد الغزل ، قم بإزالة supinate وتخزينه عند أربع درجات مئوية. هذا هو CH واحد 50 كسرا. ينحني ريس الحبيبات في 1.5 مل من المحلول البارد عالي الملح ويحتضن لمدة 20 دقيقة على الجليد.

جهاز طرد مركزي عند 16 ، 000 مرة ، G في جهاز طرد مركزي صغير عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الدوران ، قم بإزالة الجرعة الطبيعية وتخزينها على أربع درجات مئوية. هذا هو كسر CH 500.

أخرج الكسور المحفوظة أثناء بروتوكول التجزئة وضعها على الجليد. ثم أضف إلى الجزء السيتوبلازمي 300 ميكرولتر من خمسة كلوريد صوديوم مولي. ثم انقل 100 ميكرولتر من البكتيريا العقدية المعبأة في حبات Sphero لكل جزء إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.

أضف 10 مجلدات من المخزن المؤقت للغسيل العقدي إلى الخرز. اقلب الأنبوب للخلط والطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 1000 مرة. G في جهاز طرد مركزي منضدية ، تخلص من sna.

كرر الغسيل المخزن المؤقت مرتين ، ثم ثني ريس الحبيبات بحجم متساو من المخزن المؤقت للغسيل العقدي ، وأضف 200 ميكرولتر من البكتيريا المغسولة تعمل في ملاط الخرز لكل جزء. قم بتدوير الأنابيب لمدة ساعة عند أربع درجات مئوية. ثم الطرد المركزي الأنابيب لمدة دقيقة واحدة عند 1000 مرة G من أربع درجات مئوية ، وتخلص من supinate.

ثم أضف ملليلترا واحدا من مخزن الغسيل إلى حبات الخرز المحتضن بالجزء السيتوبلازمي في أنبوب سعة 15 مل. أضف مخزن الغسيل وانقل الخرزات إلى أنبوب سعة 1.5 مل. اغسل الخرزات لمدة دقيقة واحدة ، ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة دقيقة واحدة عند 1000 مرة جم عند أربع درجات مئوية.

كرر مرتين بعد خطوة الغسيل الأخيرة. قم بإزالة جميع آثار عازلة الغسيل باستخدام طرف ماصة مسطح. ثم أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت elucian واخلط الأنابيب برفق وضعها على الثلج لمدة 15 دقيقة.

أثناء الحضانة ، اخلطي الخرزات أحيانا عن طريق النقر برفق على قاع الأنابيب. بعد مرور 15 دقيقة ، يتم اختيار جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 1000 مرة G عند أربع درجات مئوية. اجمع Senna الذي يحتوي على VRPs العقدية الموسومة بعلامة البكتيريا.

أصيب خلايانا بسلالة فيروس الأنفلونزا ، WSN لمدة تسع ساعات ، وتم تحليل المحللات المجزأة عن طريق الإزهار الغربي كما هو موضح هنا. يستخرج العزل النووي اللطيف بروتينات السيتوبلازم بكفاءة مثل التوبولين مع تجنب إطلاق البروتينات النووية الوفيرة. لاحظ أن جزء الكروماتين المستخرج بملح منخفض غني بالبروتينات المهمة للنسخ.

في حين أن الجزء العالي من الملح يحتوي بشكل أساسي على نيوكليوسومات لتحديد تركيبة البروتين للجزء السيتوبلازمي المملوء, V NPS من الخلايا R المصابة لمدة تسع ساعات بفيروس غير موسوم ، RWSN أو RWSN PB اثنين من البكتيريا العقدية تم تحليلها عن طريق تلطيخ الفضة كما هو موضح بالنسبة للشطف السيتوبلازمي. هنا توجد نسبة عالية من NP إلى PA PB واحد ، PB اثنين كما يتضح من النطاق الرئيسي فوق 55 كيلوڈالتون مقارنة بالنطاقات بين 95 و 100 كيلودالتون مما يشير إلى أن معظم البكتيريا العقدية PB الثانية يتم تنقيتها كجزء من VRNP كامل التكوين ، أو بمعنى آخر ، يتم التقاط القليل من البوليميراز القابل للذوبان لمقارنة الغلة النسبية. VR NPS المنقى بعد تسع ساعات من الإصابة ب RWSN PB اثنين من البكتيريا العقدية أو RWSN أو الفضة الملطخة كما هو موضح في هلام البقع الفضي هذا ، يمكن تنقية RMPs من جميع الكسور الخلوية الأربعة بعد تسع ساعات من الإصابة.

تم العثور على أعلى تركيز من v RMPs في البلازما النووية ، على الرغم من أنه يمكن أيضا تنقية أجزاء كبيرة من السيتوبلازم والكروماتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية الغلة العالية من مجمعات البروتين النووي الريبي لفيروس الأنفلونزا السليمة من نواة الخلايا المصابة. عند تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام مخازن مؤقتة نظيفة وتجنب تعريض العينات دون داع لدرجة حرارة الغرفة لأنه بهذه الطريقة يمكنك تجنب كل من الحمض النووي الريبي وتدهور البروتين ، وكذلك تجنب تفكيك مركب البروتين.

ولا تنس أن العمل مع فيروس الأنفلونزا المعدية يمكن أن يكون خطيرا. يجب تنفيذ جميع الخطوات تحت طاولة عمل من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية حتى تتم إضافة NP 40 إلى الأحجار الكريمة.