طريقتين لتشكيل متغايرة النوى إلى اكتشاف العوامل تقييد HCV

الهدف من هذا الإجراء هو استقصاء تأثير عوامل التقييد على إكمال دورة تضاعف فيروس التهاب الكبد C في أي خط خلوي محدد، وذلك باستخدام طريقتين تعتمدان على تكوين الهياكل الخلوية؛ تبدأ الطريقة الأولى بزراعة خلايا كبد بشرية بالإضافة إلى خلايا التعبئة heal A و Hep 56 1D، ثم يتم بعد ذلك نقل حمض HCV RNA إلى خلايا الكبد عن طريق التثقيب الكهربائي. ولاحقاً، يتم دمج الخط الخلوي المضاعف لفيروس HCV مع خط خلايا التعبئة المقابل باستخدام البولي إيثيلين جليكول في طريقة الدمج الثانية. وتتمثل الخطوة الأولى في إنتاج مخزون من فيروس HCV ذو عيار مرتفع.

يتم بعد ذلك إجراء زراعة مشتركة لخطوط خلوية مختلفة، ويُحفز اندماج الخلايا عن طريق ترانسفكشن البروتين السكري للفيروس الرغوي النموذجي. بعد ذلك، تُصاب الخلايا الهجينة بفيروس HCV. وبناءً على أي من طريقتي تكوين الخلايا الهجينة، يتم إجراء المجهر الفلوري للتأكد من الاندماج، كما يتم قياس كمية الجسيمات المعدية المنتجة.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في فائدتها لفحص مجموعة واسعة من الخطوط الخلوية والخلايا الأولية للكشف عن تعبير عوامل التقييد السائدة الخاصة بفيروس HCV. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية حول خصوصية الأنواع ونطاقات HCV. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لتسهيل فهم المفاهيم الأساسية لنظامي الدمج مسبق تحفيز دمج الخلايا بواسطة البولي إيثيلين جلايكول.

يتم تر transfection لخلايا HUH 7.5 باستخدام H-C-V-R-N-A وفقاً للبروتوكولات القياسية، وتُزرع لمدة 24 ساعة عند 37 °C و 5% carbon dioxide. في اليوم التالي، يتم حصاد خلايا HUH 7.5 التي خضعت للـ transfection والتي تحمل الـ sub genomic replicon، بالإضافة إلى خلايا التغليف heal R و hep 56 1D. وقد تم هندسة خلايا التغليف هذه للتعبير عن بروتينات HCV وهي core E one و E two و P seven و NS two بشكل ectopic. بعد عملية الـ trypsization، يتم إعادة تعليق الخلايا في وسط DMEM complete، ثم تُخفف معلقات الخلايا إلى التركيزات التالية: خلايا HUH 7.5 إلى 5 × 10⁵ cells/mL، وخلايا heal و hep 56 1D إلى 2 × 10⁵ cells/mL.

بعد ذلك، قم بتجهيز طبق زراعة مكون من ستة آبار يحتوي كل بئر منه على شريحتين إلى ثلاث شرائح زجاجية غطائية معقمة. ولإجراء مزيد من التحليل لكفاءة الاندماج، اخلط 1 mL من خلايا HUH 7.5 المنقولة مع 1 mL من خلايا التعبئة وازرعهما في بئر واحد من الطبق المكون من ستة آبار، ثم يتم التحضين لمدة 24 ساعة عند 37 °C و 5% carbon dioxide. بعد مرور 24 ساعة، افحص كثافة الخلايا.

يجب أن تتراوح كثافة الخلايا بين 60 إلى 80% من درجة التلاقي (confluency) قبل تحفيز اندماج الخلايا، وذلك لضمان تقارب الخلايا بما يسمح باندماج أغشيتها؛ قم بسحب الوسط من الخلايا المستزرعة معاً واغسلها مرة واحدة باستخدام 1 mL من PBS. بعد ذلك، أضف بعناية 500 µL من 40% polyethylene glycol أو PEG 1,500 المسخن مسبقاً. أضف 500 µL من PBS إلى بئر آخر من الخلايا المستزرعة معاً ليكون بمثابة عينة ضابطة؛ قم بالتحضين لمدة خمس دقائق عند 37 °C لتحفيز تكوين الخلايا متباينة النوى (heterokaryons). اسحب PEG وأضف بعناية 2 mL من PBS، وبعد مرور دقيقة واحدة، اسحب PBS وأضف 2 mL من PBS طازج. اغسل باستخدام PBS من 3 إلى 5 مرات لمدة دقيقة واحدة لكل غسلة لإزالة PEG الزائد.

أخيراً، أضف 2 mL من وسط DMEM الكامل إلى كل بئر، ثم قم بالتحضين عند 37 °C و 5% CO2 لمدة 48 ساعة. بعد 48 ساعة من الاندماج، قم بجمع كل SNAT وقم بتصفيته باستخدام مرشح 0.45 micron. بعد جمع SNAT المزرعة الخلوية، يمكن تحديد كفاءة الاندماج عن طريق الفلورة المناعية؛ اغسل الآبار التي تحتوي على شرائح غطاء زجاجية مرة واحدة باستخدام 1 mL من PBS لمدة دقيقة واحدة.

قم بتثبيت الخلايا باستخدام 600 µL من البارالدهيد بتركيز 3% في PBS لمدة 15 دقيقة. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة دقيقة واحدة في كل غسلة. بعد الغسلة النهائية، استخدم ملقطاً لنقل الشرائح الغطائية بعناية إلى طبق يحتوي على 24 بئراً، ثم اجعل الخلايا نفاذة باستخدام 500 µL من Triton X 100 بتركيز 0.5% في PBS لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، اغسل ثلاثة مرات بـ PBS، ثم أضف 250 µL من محلول الأجسام المضادة الأولية إلى كل بئر. استخدم الجسم المضاد anti NS5 بتركيز 0.5 µg/mL والجسم المضاد human monoclonal anti E2 بتركيز 6.4 ng/mL. قم بالتحضين لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وبعد مرور 45 دقيقة، اغسل ثلاثة مرات بـ PBS.

بعد ذلك، أضف 250 µL من الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر؛ حيث تُستخدم أجسام مضادة ثانوية من الماعز مضادة للفأر أو أجسام مضادة من الماعز مضادة للبشر خاصة بـ IgG والمقترنة بـ Alexa Fluor 546 أو Alexa Fluor 488 بتركيز 2 µg/mL. تُحضن العينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام، وبعد مرور 30 دقيقة، تُغسل مرة واحدة باستخدام PBS.

بعد ذلك، صبّغ نوى الخلايا باستخدام 250 microliters من DPI المخفف بنسبة 1 إلى 3000 في PBS. يتم التحضين لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام، ثم تُغسل أربع مرات باستخدام PBS ومرة واحدة بالماء. وفي النهاية، ثبّت شرائح التغطية مقلوبة فوق قطرة من flora mount على شريحة مجهرية واتركها تجف في الظلام.

لبدء هذا الإجراء، يتم حصاد وتحضير معلقات خلوية أحادية من الخلايا التالية: خط خلايا الكبد البشرية Luna NA الذي يفتقر إلى التعبير الداخلي عن CD 81، وخلايا HEK 293T المخصصة للتغليف (packaging cells)، وخلايا Hep 56 1D التي تعبر بشكل مستقر عن CD 81 البشري. يتم استزراع خلايا Luna N بالتجاور مع خلايا HEK 293T بنسبة واحد إلى واحد، ومع خلايا Hep 56 1D hCD 81 بنسبة واحد إلى اثنين، بحيث تكون الكثافة الخلوية الإجمالية 1.5 × 10⁵ خلية لكل بئر.

تُحضن الآبار لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و5% ثاني أكسيد الكربون، وفي اليوم التالي، يتم نقل بروتين الغلاف PFE عالي التعبير جينياً إلى الخلايا بشكل عابر باستخدام Lipofectamine 2000 وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وبعد 30 ساعة من عملية نقل البروتين السكري PFE، تُلقح الخلايا الهجينة بـ 350 ميكرولتر من مخزون فيروسي مُعد مسبقاً بمعدل عدوى (MOI) يبلغ حوالي 2.3.

يتم التحضين لمدة 12 ساعة عند 37 °C و5% carbon dioxide في صباح اليوم التالي. تُغسل المزارع مرة واحدة باستخدام PBS ويُضاف 1 mL من الوسط الغذائي DMEM الكامل لكل بئر، ثم تُحضن لمدة 48 ساعة عند 37 °C و5% carbon dioxide. بعد مرور 48 ساعة، يتم جمع السائل الطافي من مزارع hetero carion، ثم يُرشح السائل الطافي عبر مرشح بمسامية 0.45 micron. بعد ذلك، يُستخدم السائل الطافي لتلقيح خلايا HUH 7.5 التي تم استزراعها في أطباق ذات 96 بئراً في اليوم السابق ضمن مقايسة التخفيف المحدود (limiting dilution assay)، وتُحضن لمدة 72 ساعة قبل قياس كمية الجسيمات النسلية المعدية المنتجة.

يجب إكمال إجراء تصوير أحداث الاندماج قبل ست ساعات من الزراعة المشتركة؛ اغسل الخلايا الملتصقة مرة واحدة باستخدام 5 mL من PBS، ثم أضف 4 mL من محلول DI المناسب لكل طبق بقطر 10 cm. حضن الخلايا لمدة 45 دقيقة عند 37 °C و 5% carbon dioxide. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 5 mL من PBS لمدة دقيقة واحدة، ثم أضف وسط DMEM الكامل. حضن الخلايا لمدة ست ساعات عند 37 °C و 5% carbon dioxide قبل عملية الاستزراع. أضف شريحة غطاء إلى كل بئر من أطباق الـ 12 بئرًا، بعد ذلك قم باستزراع ونقل الجينات وصبغ الخلايا كما تم توضيحه سابقًا. بعد 30 ساعة من نقل الجينات، اغسل الخلايا بعناية باستخدام 1 mL من PBS لمدة دقيقة واحدة، ثم ثبت الخلايا باستخدام 250 µL من 3% paraldehyde لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 mL من PBS لمدة دقيقة واحدة، ثم صبغها بـ dappy لمدة دقيقة واحدة. بعد غسل الخلايا مرة واحدة بـ PBS ومرة واحدة بالماء، قم بتثبيت شرائح التغطية والشرائح الزجاجية في النهج الأول للتحقيق في تأثير عوامل التقييد على اكتمال دورة تضاعف HCV. في الكارونات غير المتجانسة، تم نقل ريبليكون دون جينومي يعبر عن ترانسجين لوسيفيريز وبروتينات HCV غير التركيبية مؤقتاً إلى خلايا HUH 7.5 أولاً، ثم تمت زراعتها بشكل مشترك ودمجها مع خطوط خلوية تعبر عن بروتينات HCV التركيبية core والبروتينات الملحقة. تظهر نتيجة ممثلة في هذا الشكل حيث تم صبغ الخلايا مناعياً باستخدام أجسام مضادة وحيدة النسيلة ضد البروتين التركيبي E2 والبروتين غير التركيبي NS5A.

تظهر الصور في اللوحات العلوية أنه عند المعالجة بـ PEG، تم الكشف عن إشارات كل من MS five A و D two في آن واحد داخل السيتوبلازم نفسه، مما يشير إلى حدوث اندماج ذاتي. وفي المقابل، توضح اللوحات السفلية أنه عند معالجة الخلايا المستزرعة معاً بـ PBS، لم يتم تحفيز أي اندماج. وبالتالي، لم يتم ملاحظة أي تموضع مشترك للإشارات. ولتقدير القدرة المعدية للفيروسات الناتجة من الكارونات غير المتجانسة، جُمعت العينات من المستزرعات المشتركة بعد 48 ساعة من تحفيز الاندماج، واستُخدمت لتلقيح خلايا HUH 7.5 الساذجة لإجراء مقايسات لوسيفيراز لاحقة.

في هذا الرسم البياني، يتم عرض متوسط قيم ثلاث تجارب مستقلة. ويمثل الشريط الأفقي الرمادي الخلفية لوحدات الضوء النسبية أو RLU التي تم تحديدها في خلايا HUH 7.5 غير المصابة. ومن الملاحظ أنه عندما تم دمج خلايا HUH 7.5 المكررة مع خطوط خلوية ساذجة أو معالجتها بـ PBS كعينة ضابطة، لم يتم اكتشاف أي قدرة معدية في سوائل المزرعة.

ومع ذلك، عندما تم تحفيز الاندماج الخلوي بين خطوط خلايا ريبليكون HUH 7.5 وخلايا التعبئة بواسطة PEG، تم إطلاق جسيمات فيروسية معدية في سوائل المزرعة. ويشير هذا إلى أن إنتاج الفيروس يتطلب اندماجاً خلوياً وتعبيراً عن البروتينات الفيروسية في خطوط خلايا التعبئة؛ ومن المثير للاهتمام أن الخلايا الهجينة من خلايا سرطان الكبد البشري HUH 7.5، وكذلك الخلايا الهجينة من خلايا كبد بشرية غير حية وخلايا كبد الفئران، قد سمحت جميعها بإطلاق الفيروس، مما يشير إلى أن عمليات التجميع والإطلاق لا تُثبط بشكل مهيمن بواسطة عوامل التقييد المحتملة في هذه الأنواع من الخلايا. وفي نهج بديل، تم تحفيز اندماج الخلايا الجسدية عن طريق التعبير عن بروتين سكري جيني بعد زراعة الخلايا.

تم تصور الخلايا الهجينة (Hetero carons) عن طريق صبغ خطوط خلوية منفصلة بصبغات تتبع الخلايا قبل الزراعة المشتركة والترانسفكشن، وقد تم تثبيت الخلايا والبروتينات الجينية وصبغها بـ DPI بعد 30 ساعة من الترانسفكشن، وتظهر نتيجة ممثلة في هذا الشكل. ويُستدل على اندماج نوعين من الخلايا بوجود خلية هجينة تحتوي على صبغات موزعة بشكل متجانس داخل السيتوبلازم كما هو موضح هنا. وفي المقابل، تظهر الصور في اللوحة السفلية غياب الخلايا ذات السيتوبلازم المصبوغ بصبغة مزدوجة، مما يشير إلى عدم حدوث اندماج خلوي.

يظهر هذا الرسم البياني النهائي أن جميع عوامل دخول فيروس التهاب الكبد الوبائي C (HCV) يتم التعبير عنها فقط في الخلايا الحاملة غير المتجانسة من خلايا Luna N مع خلايا hela أو Hep 56 1D التي تعبر عن بروتين CD 81 البشري. هنا، تم تلقيح المزارع بجزيئات HCV معدية. جُمعت سوائل المزارع بعد 48 ساعة، وتم تحديد إطلاق الجزيئات المحدثة (de novo) من الخلايا الحاملة غير المتجانسة عن طريق مقايسة التخفيف المحدود باستخدام خلايا HUH 7.5 المستهدفة الساذجة. تظهر القيم المتوسطة لثلاث تجارب مستقلة، ويمثل الشريط الأفقي الرمادي حد الكشف الخاص بالمقايسة.

كمجموعة ضابطة، دُمجت خلايا lunar N مع خلايا lunar N أخرى، مما أدى إلى مستويات منخفضة جداً من فيروس التهاب الكبد C (HCV) المعدي، كانت قريبة من حد الكشف. كما تم الحصول على نتائج مماثلة عند دمج خلايا lunar N مع خلايا naive HEP 56 1D. وفي كلتا الحالتين، كان البروتين البشري CD 81 غائباً، لذا لم يتمكن فيروس HCV من إصابة الخلايا الهجينة بشكل منتج.

وفي المقابل، لوحظ إنتاج جديد (de novo) لنسل فيروسي معدٍ يزيد بنحو عشرة أضعاف عن خلفية المقايسة في خلايا lunar 10 المدمجة مع heer وفي خلايا lunar hand المدمجة مع خلايا HEP 56 1D التي تعبر عن البروتين البشري CD 81. ويشير هذا إلى أن فيروس HCV قد أكمل دورة تكاثره بنجاح في RetroCars، مما ينفي وجود تعبير عن عوامل تقييد سائدة في هذه الخطوط الخلوية. وبمجرد إتقان العملية، يمكن إتمام الإجراء التجريبي الكامل في غضون أسبوع واحد إذا نُفذ بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية توليد الـ hetero carryon لتحديد عوامل تقييد HV المحتملة. تذكر أن العمل مع فيروس التهاب الكبد C يمكن أن يكون خطيرًا للغاية، ويجب دائمًا مراعاة الاحتياطات مثل معايير السلامة البيولوجية العالية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.