عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي واستخدامها في دراسة التهجير تحت ظروف تدفق العدلات

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل خلايا بطانية بشرية عالية الجودة واستخدامها لفحص الآليات التي تنظم الهجرة العابرة للخلايا المتعادلة تحت ظروف التدفق السفلي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل وزراعة الخلايا البطانية لوريد الحبل السري البشري. وتتمثل الخطوة الثانية في تقسيم الخلايا إلى غرف IBD.

بعد ذلك، يتم توزيع الخلايا المتعادلة البشرية المعزولة حديثاً فوق الخلايا البطانية المنشطة، مما يؤدي إلى تدحرج الخلايا المتعادلة ثم التصاقها القوي وهجرتها عبر البطانة. وتتمثل الخطوة النهائية في قياس كمية الهجرة عبر البطانة باستخدام المجهر الفيديو. وفي نهاية المطاف، يمكن استخدام المجهر الفلوري والمجهر ذو المجال المضيء لتقييم هجرة الخلايا المتعادلة عبر الخلايا البطانية المنشطة.

يعد عزل الخلايا البطانية أمراً سهلاً في الوصف، ولكنه صعب التعلم جزئياً لأن الخطوات الرئيسية تتطلب رؤية بصرية للحبل السري. لهذا السبب، يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية. ستساعدنا هذه الطريقة على فهم أسئلة رئيسية في مجال الالتهابات، مثل كيفية حدوث تجنيد الكريات البيضاء تحت ظروف التدفق، وكيفية تصرف الخلايا البطانية تحت ظروف التدفق بشكل أفضل.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول استقطاب الخلايا المتعادلة أثناء الالتهاب، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على المجموعات النادرة من الكريات البيضاء مثل الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا الحمضية. يقوم هونغ جانغ، وهو فني في مختبري، بتوضيح هذا الإجراء جنباً إلى جنب مع ريتو شارما. قبل ساعة واحدة على الأقل من الإجراء، يتم التحضير مسبقاً، ثم تُحضن قارورة T 75 تحتوي على الجيلاتين عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك، ابدأ بإجراء عزل الخلايا البطانية داخل غطاء التدفق الصفائحي باستخدام مقص لقطع الحبل السري من المشيمة. بعد ارتداء قفازات معقمة، افحص الحبل السري بدقة وتخلص من أي أجزاء تحتوي على جلطات دموية أو تضررت بسبب تثبيت الحبل أثناء الولادة. ثم حدد الشريانين والوريد الوحيد الموجودين في الحبل السري.

بعد ذلك، أدخل بلطف كانيولا متصلة بصنبور إيقاف ثنائي الاتجاه في أحد طرفي الوريد، ثم ضع مشبكاً حول الكانيولا لتثبيتها بإحكام في موضعها. يُعد تروية الحبل السري أحد أصعب أجزاء هذه العملية؛ ولضمان إتمام ذلك بنجاح، قم بتروية الحبل بمحلول منظم زائد وراقب التدفق حتى يصبح صافياً.

قم بتروية الوريد باستخدام محلول منظّم للحبل السري حتى يصبح التدفق صافياً، ثم أغلق طرف الحبل السري باستخدام ملقط. قد يظهر أحياناً أثناء التروية ثقب صغير نتيجة قيام الأطباء بسحب دم الحبل السري من الحبل السري. في هذه الحالات، يمكن استخدام الملاقط الشريانية لسد الثقب ومواصلة التروية أثناء عزل الخلايا البطانية.

من الأهمية بمكان ضبط توقيت المعالجة بإنزيم الكولاجيناز بدقة؛ فالفترة الزمنية القصيرة جداً لن تسمح بحصد عدد كافٍ من الخلايا البطانية، بينما قد تؤدي الفترة الطويلة جداً إلى تلوث العينة بخلايا العضلات الملساء أو حدوث تلف في الخلايا البطانية. بعد ذلك، قم بتروية الوريد بإنزيم الكولاجيناز الدافئ المحضر حديثاً.

أغلق صمام التوقف واحضن الحبل السري في دورق يحتوي على محلول منظم للحبل السري (cord buffer) دافئ. بعد 10 دقائق، أخرجه ثم دلك الحبل السري برفق لفصل الخلايا البطانية عن تجويف الوريد. قم بتصريف المحلول في أنبوب يحتوي على خمسة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا البطانية (ECM)، مع غسل الحبل السري بمحلول منظم للحبل السري مرتين لإزالة أي خلايا متبقية.

الآن قم بطرد الخلايا مركزياً لمدة 10 دقائق عند 350 ×g. وفي درجة حرارة الغرفة، أزل السائل الطافي ثم أعد تعليق الراسب. في 10 milliliters من وسط زراعة الخلايا البطانية، انقل الخلايا إلى قارورة T 75 مغطاة بالجيلاتين وقم باستزراع الخلايا البطانية طوال الليل عند 37 °C و 5% CO2. وفي اليوم التالي، رج القارورة برفق لإزالة أي خلايا دم حمراء عالقة.

بعد ذلك، قم بإزالة السائل الطافي واغسل مزرعة الخلايا البطانية بمحلول HBSS الدافئ. وبعد إزالة HBSS، قم بتغذية الخلايا بـ 10 milliliters من وسط ECM الدافئ. ثم افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من إزالة خلايا الدم الحمراء ولتقييم درجة الالتحام ومورفولوجيا الخلايا البطانية.

استمر في تغيير الوسط الغذائي كل ثلاثة أيام حتى تصل الخلايا إلى درجة التلاقي. عند هذه النقطة، قم بتقسيم الخلايا باستخدام محلول trypsin وEDTA. ثم احصد الخلايا المنفصلة وأعد تعليقها في ECM.

أخيرًا، قم بطلاء كل بئر من آبار غرفة IBD بالجيلاتين. تخلص من الجيلاتين الزائد، ثم أضف 1.5 × 10⁶ لكل ملليلتر من معلق الخلايا البطانية في كل بئر من آبار الغرفة. ابدأ بتحفيز زيادة تعبير جزيئات الالتصاق والتنشيط على سطح الخلية عن طريق تحضين الخلايا البطانية مع محفز مناسب أثناء عملية تنشيط الخلايا البطانية.

اعزل الخلايا المتعادلة من الدم المحيطي لمتطوعين بشريين أصحاء عن طريق الطرد المركزي الكثافي كما نُشر سابقاً، ثم علّق الخلايا بتركيز 1 × 10⁶ لكل مل في محلول HBSS مضاف إليه ألبومين بشري. بعد إعداد المجهر، قم بتوصيل غرفة IBD التي تحتوي على الخلايا البطانية المحفزة بأنابيب المجهر. اختر العدسة الشيئية ذات التباين الطوري 10x، ثم اضبط مضخة السرنجة للسحب وبدء تدفق محلول HBSS عند إجهاد القص المطلوب.

أوقف التدفق لفترة وجيزة عن طريق تدوير صنبور الإيقاف ثلاثي الاتجاهات في جانب المخرج إلى وضع الإغلاق، وتحويل خط المدخل من HBSS إلى الخلايا المتعادلة المعزولة. ابدأ التدفق مرة أخرى عن طريق تدوير صنبور الإيقاف مرة أخرى إلى وضع التشغيل. ثم ابدأ التسجيل باستخدام كاميرا CCD متصلة بجهاز تسجيل DVD.

ابدأ المؤقت. عندما تدخل الخلايا المتعادلة (neutrophils) إلى الحجرة بعد أربع دقائق، عد إلى استخدام HBSS لمنع التصاق خلايا متعادلة جديدة. إذا كانت البيانات المطلوبة تتعلق بإجمالي التفاعلات من التدحرج والالتصاق الوثيق، فاستخدم العدسة الشيئية ذات التكبير 10x بنظام تباين الطور.

استخدم عدسة شيئية لتصوير ستة حقول عشوائية لمدة 10 ثوانٍ لكل منها بين الدقيقتين الرابعة والخامسة. أخيراً، انتقل إلى عدسة شيئية بقوة 40x وسجل حقل رؤية واحد في الوقت المطلوب. بعد تروية الخلايا المتعادلة عند الدقيقة 10، قم بجمع ما بين خمسة إلى 10 حقول رؤية عشوائية.

لا تدعم الخلايا البطانية غير المحفزة تجنيد الخلايا المتعادلة. لذلك، توضح الأشكال التالية تفاعل الخلايا المتعادلة مع الخلايا البطانية المحفزة بواسطة TNF alpha. لاحظ الخلية المتعادلة الملتصقة كما يشير رأس السهم الأصفر، والخلية المتعادلة المهاجرة عبر البطانة كما يظهر برأس السهم الأبيض.

يمكن أن يحدث انتقال الخلايا المتعادلة عند الموصلات الخلوية أو من خلال الخلايا البطانية نفسها. وللتمييز بين هاتين الحالتين، تم وسم الخلايا البطانية باستخدام جسم مضاد متماسك ضد VE. وكما هو موضح هنا باللون الأحمر، يتم تقييم الانتقال على أنه يحدث إما عبر الخلايا (paracellular) أو من خلال الخلايا (transcellular).

في هذا النموذج، تكون جميع عمليات الانتقال عبر الخلايا تقريبًا بين خلوية، كما يتضح من هذا الشكل الذي يظهر تراكب الشكلين السابقين. في الرسم البياني الأول من بين ثلاثة رسوم بيانية، تم فحص وقياس تفاعلات الخلايا المتعادلة باستخدام برنامج image J. يلاحظ أن تفاعلات الخلايا المتعادلة مع الخلايا البطانية التي تم تنشيطها بواسطة TNF alpha كانت أكثر بكثير مما كانت عليه مع الخلايا البطانية الضابطة غير المنشطة.

تم توصيف إجمالي الخلايا المتفاعلة بشكل أكبر على أنها خلايا متدحرجة أو ملتصقة بإحكام أو مهاجرة عبر الخلايا كما سبق. حدثت عملية هجرة للخلايا المتعادلة بشكل ملحوظ في الآبار التي تحتوي على خلايا بطانية منشطة بعد عزل الخلايا البطانية. يمكن إجراء طرق أخرى مثل لطخة ويسترن (western blotting) وتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real time PCR) وقياس المقاومة البطانية للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق ببيولوجيا الخلايا البطانية بعد التطوير.

ستساعد هذه الطريقة الباحثين في مجال الالتهابات وبيولوجيا الأوعية الدموية على فهم كيفية حدوث تجنيد الكريات البيضاء في ظل ظروف التدفق في نموذج نظام بشري. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا البطانية لوريد الحبل السري البشري واستخدامها لدراسة هجرة الخلايا المتعادلة عبر البطانة في ظل ظروف التدفق باستخدام غرفة ity.