والإنسان النموذجي قناة فالوب للتحقيق في

تُعد بكتيريا Chlamydia trachomatis بكتيريا سالبة الجرام وإجبارية العيش داخل الخلايا. وتُعرف أنماط مصلية مختلفة من الكلاميديا تتسبب في عدوى العين أو الجهاز التناسلي. وتعتبر عدوى الجهاز التناسلي بـ Chlamydia trachomatis أكثر الأمراض المنقولة جنسياً شيوعاً في جميع أنحاء العالم.

وقد وُجدت بمعدل انتشار بلغ ما يقرب من 3 مليون عدوى مُبلغ عنها في الاتحاد الأوروبي من عام 1990 إلى عام 2009. حيث تم الإبلاغ عن ما يقرب من 400,000 حالة في عام 2009. وعلى الرغم من التحسن المستمر في الصحة العامة والتثقيف الجنسي، إلا أنه لوحظ ارتفاع في معدل الإصابات التناسلية الجديدة بـ chlamydial من 70,000 حالة في عام 1990 إلى 400,000 حالة في عام 2009.

يُبلغ عن 75% من جميع الإصابات الجديدة لدى الشباب الذين تتراوح أعمارهم بين 15 و 24 عاماً. ويُفترض أن تحدث التبعات السريرية نتيجة للتخلص غير الفعال من المسببات المرضية، مما قد يؤدي إلى حدوث إصابات صاعدة من الجهاز التناسلي السفلي إلى العلوي، وتسبب لاحقاً ضرراً التهابياً مزمنًا في الأنسجة المصابة. وتصاب 10 إلى 30% من النساء المصابات بـ chlamydia tracheitis بمرض التهاب الحوض PID، وتُعزى ما يصل إلى 50% من حالات PID إلى إصابات chlamydia tracheitis.

ونتيجة لذلك، وُجدت الكلاميديا (chlamydia) كعامل مسبب للمرض في 50% من المريضات اللواتي يعانين من العقم الأنبوبي، وفي 40% من المريضات المصابات بالحمل خارج الرحم. وفي حالة المرأة السليمة غير المصابة، تنتقل البويضة المخصبة عبر قناة فالوب إلى الرحم حيث تنمو حتى الولادة. أما في المريضات المصابات، فقد تنتقل الكلاميديا من الجهاز التناسلي السفلي إلى قناة فالوب، مما يؤدي إلى تحفيز عمليات التهابية مزمنة.

يُفترض أن يؤدي تلف الخلايا الظهارية الناجم عن المسببات المرضية وفقدان الوظائف المركزية للخلايا الظهارية في النهاية إلى انسداد قناة فالوب، مما يؤدي إلى تقليل أو إلغاء نقل البويضات تماماً من المبيضين إلى الرحم. ولتحقيق هذا الغرض، يتم جمع وتخزين قنوات فالوب البشرية من النساء اللاتي يخضعن لعملية استئصال الرحم. ثم يتم تشريح القنوات وفتحها بعناية.

وفقاً للتجهيزات التجريبية، يتم تقطيعها إلى عينات صغيرة وإصابتها بالأجسام الأولية لبكتيريا chlamydia tracheitis المعدية لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة بعد نقاط زمنية محددة. تُثبّت العينات باستخدام مثبت مونتي (Monty's fixative) لمدة ثلاثة أيام على الأقل حتى يتم التحضير اللاحق. تُخزن أنابيب فالوب البشرية HFT المأخوذة من النساء اللاتي يخضعن لعملية استئصال الرحم فوراً بعد الجراحة.

في وسط RPMI يحتوي على 5% FCS بدون مضادات حيوية في درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى يحين وقت التحضير. يتم تشريح قناة فالوب البشرية في طبق بتري يحتوي على وسط RPMI مع 5% FCS بدون مضادات حيوية طوال فترة المعالجة. يجب أن تظل القناة مغمورة في الوسط لمنع الجفاف، مع قص واستبعاد الأنسجة الضامة والأنسجة التي تضررت أثناء الجراحة.

بعد التشريح، افتح HFT بعناية باستخدام مشرط صغير. تجنب إتلاف الأنسجة من خلال التعامل غير الحذر بالملاقط والمشرط. قم بتحضير قطع صغيرة من النسيج بحجم خمسة في خمسة مليمترات للعدوى، واحفظ عينة HFT في 1 ml من RPMI يحتوي على 5% FCS بدون مضادات حيوية وأضف C track.

يتم تحضين عينة HFT للأجسام الأولية لـ OMAS لمدة تصل إلى 48 ساعة في درجة حرارة 37 degrees Celsius، و5%CO2 و20%O2 داخل حضانة عادية أو في بيئة منخفضة الأكسجين، بنسبة أقل من 5%O2 في غرفة نقص الأكسجة. وبعد نقاط زمنية محددة من التحضين، يتم جمع العينات وتخزينها في مثبت Monty's Fixative لمدة ثلاثة أيام على الأقل في درجة حرارة four degrees Celsius حتى يتم التحضير لـ SEM أو TEM المجهر الإلكتروني النافذ. يتم تقطيع النسيج المثبت إلى قطع صغيرة غسلها ثم تحضينها مع 1%osse وtetroxide طوال الليل.

بعد عدة خطوات من الغسل والتجفيف، تُنقل العينات المجففة إلى راتنج "أيت" (aite) مُحضّر حديثاً وتُبلمر لمدة 48 ساعة عند 60 °C. وبعد التشذيب، يتم قطع مقاطع شبه رقيقة ومقاطع فائقة الرقة ونقلها إلى شرائح أو شبكات على التوالي. وبعد التلوين، يمكن فحص المقاطع شبه الرقيقة باستخدام المجهر الضوئي من أجل المجهر الإلكتروني النافذ.

أخرج العينة من مثبت مونتي (Monty's fixative) وقطعها إلى قطع يصل حجمها إلى 2 × 2 × 5 مليمتر. بعد الغسيل والحضن في محلول منظم صوديوم CCO dilate، والغسل برابع أكسيد الأوزميوم، والتجفيف، والتعريض لتركيزات تصاعدية من الإيثانول، انقل العينة إلى خليط مكون من 50% propylene oxide و aite طوال الليل. وفي اليوم التالي، انقلها إلى aite محضر حديثاً لمدة ساعة واحدة على الأقل.

ثم يتم النقل إلى قوالب مسطحة وتعبئتها بـ aite وترك aerd dite ليبلمر لمدة 48 ساعة عند 60 degrees Celsius. بعد تشذيب العينة المدمجة، تُقطع قطاعات شبه رقيقة بسمك 700 nanometers تقريبًا أو قطاعات فائقة الرقة بسمك 70 nanometers باستخدام ultra microtome مجهز بسكين زجاجية أو يفضل سكين ماسية. يتم تحليل العينة في القطاعات شبه الرقيقة والفائقة الرقة بواسطة المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني النافذ، أما بالنسبة للمجهر الإلكتروني الماسح.

تُثبت العينات بدبابيس على ألواح من الفلين بحيث تكون الظهارة مواجهة للأعلى، ثم تُغسل وتُجفف باستخدام تركيزات متزايدة من الأسيتون. بعد التجفيف في جهاز تجفيف النقطة الحرجة، تُنقل العينات إلى حامل عينات المجهر الإلكتروني الماسح وتُطلى بالبلاتين أو الذهب أو البالاديوم باستخدام جهاز طلاء بالترذيذ. بعد ذلك، تصبح العينات جاهزة للتحليل باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح لإجراء الفحص بالمجهر الإلكتروني الماسح.

أخرج العينة من مثبت مونتي (Monty's fixative) ووجّه قطعة النسيج بحيث تكون الظهارة متجهة للأعلى على لوح من الفلين وثبتها في مكانها باستخدام دبابيس الحشرات. بعد الغسل بمحلول Sodium caco dilate buffer والمعالجة بالأسيتون، جفف العينة في مجفف النقطة الحرجة (critical point dryer). بعد نقل العينة من الفلين إلى حامل عينات SEM، قم بإعداد طلاء موصل من البلاتين والذهب أو البالاديوم للعينة باستخدام جهاز الطلاء بالترذيذ (sputter coater)، ثم انقل العينة المطلاءة إلى المجهر الإلكتروني الماسح لمزيد من التحليل.

إن الارتفاع المستمر في معدلات الإصابة بالعدوى في الرحم لدى النساء والعواقب السريرية الوخيمة للعدوى الصاعدة هي المبرر لتكثيف الأبحاث الأساسية والترجمية في هذا المجال. لقد استفدنا من نموذج نسيجي خارج الجسم لقناة فالوب البشرية، والذي أنشأته سابقاً مجموعة St.Perus، وذلك للتوصيف المورفولوجي للتلف الخلوي الناجم عن chlamydia في قناة فالوب. وباستخدام هذه الطريقة، لوحظ تشكل اشتمالات داخل خلوية في مراحل تطورية مختلفة، مما يظهر كلاً من العدوى المتضاعفة والمستمرة.

ومع ذلك، لا تزال الأدلة التجريبية على وجود الكلاميديا المستمرة في أنسجة قناة فالوب البشرية مفقودة، وتتطلب مزيداً من التحليل للكلاميديا، والذرية، وزيادة تنظيم نسخ جينات الاستمرار. وأحد القيود الرئيسية لهذا النموذج هو غياب الخلايا الالتهابية، مما يعيق تحليل التأثيرات الثانوية الناتجة عن عدوى KLA الزرقاء الأولية. ومع ذلك، يبدو هذا النموذج مناسباً لتحليل الظروف البيئية مثل محتوى الأكسجين في سياق تلف الخلايا الظهارية لقناة فالوب، ولتحليل الاستجابة المناعية الأولية للمضيف ضد العدوى الزرقاء الحادة.

تتمثل إحدى الأهداف المستقبلية في إنشاء نموذج أكثر تفصيلاً لاختبار التركيز المثبط الأدنى (MIC) لوحدات التكاثر الخلوي (CTUs) في نموذج أنسجة قناة فالوب البشرية عند درجات pH مختلفة، واستخدام هذا النموذج لتحديد المراحل التنموية المختلفة للالتهابات الخلالية المزمنة (CLIs) من الناحية الأيضية باستخدام تقنية المجهر المسحي الليزري ثنائي الفوتون.