استخراج خلايا الحمض النووي الريبي من Neuroprecursor باستخدام بيو راد إجمالي RNA كيت

أهلاً بكم، أنا جوش ش، طالب دراسات عليا في مختبر الدكتور إد ماكي بجامعة كاليفورنيا إيرفاين. سأوضح لكم كيفية استخلاص الـ RNA من الخلايا السليفة العصبية باستخدام مجموعة BioRad to RNA mini kit. لقد استخدمت هذه المجموعة لعدة سنوات هنا في هذا المختبر، وكانت تمنحني دائماً نتائج متسقة وبإنتاجية عالية.

الخلايا التي نستخدمها هي خلايا عصبية سلفية من جنين فأر في اليوم 14.5، تم تفكيكها بشكل حاد من القشور الدماغية الجنينية، وعادةً ما نقوم بزراعتها في طبق زراعة أنسجة مكون من 24 بئراً ومعالج كيميائياً، بحيث يكون مطلياً بـ PD L واللامينين، وأقوم بزراعتها بكثافة 100,000 خلية لكل بئر. قبل أن أبدأ، يجب أن أخبركم بضرورة العمل على طاولة مخصصة لأعمال الـ RNA. وأول خطوة هي التأكد من نظافة طاولة الـ RNA.

الطريقة المناسبة لتنظيف المنضدة هي استخدام RNA zap. فهو يقوم أساساً بالقضاء على أي RNAs، والسبب في ذلك هو أن RA يقوم بتدمير RNAs الخاصة بك. الأمر الآخر هو ضرورة ارتداء القفازات دائماً عند التعامل مع عملية الاستخلاص لأن بشرتك مليئة بهذه الـ RNAs.

لذا، فهذا أمر غير مسموح به تماماً. حسناً، ما لدي هنا هو طقم BioRad total RNA mini. لقد أخرجت محتوياته، لذا اسمحوا لي أن أريكم ما هي.

أولاً، لدينا محلول PBS المعالج بـ X dep C، ومحلول إيثانول بنسبة 70% المعالج بـ DEP. لدينا محلول ترخيص الـ RNA الكلي الذي تمت إضافة الإيثانول إليه. ثانياً، لدينا غسيل منخفض الصرامة تمت إضافة إيثانول بنسبة 100% إليه، والغسيل عالي الصرامة، ومحلول تخفيف الـ DNA، وعينات الـ DNA نفسها، ومحلول استخلاص الـ RNA الكلي.

لذا، سنضع المحلول في كتلة تسخين حرارتها 70 درجة مئوية. والأشياء الأخرى التي نحتاجها هي أنابيب ذات سدادات سعة 1.5 مل. هذه الأنابيب لا تحتوي على أي DNAs أو ais، لذا تأكد من استخدام أنابيب خالية من هذه المواد.

ولدينا أنبوبان من نوع "mil capless". والأمر الأكثر أهمية على الإطلاق هو أعمدة استخلاص الـ RNA نفسها؛ فبدونها، لا يمكنك إجراء عمليات استخلاص الـ RNA.

لذا، ومن أجل تجميع هذه الأعمدة، ستحتاج إلى عمود RNA والغطاء capless 2 بحجم 2 مل، وقم بتجميعهما معاً بهذا الشكل وستكون جاهزاً للبدء. حسناً، والشيء الأخير الذي نحتاجه دائماً هو هذه الخلايا؛ حيث أن الخلايا المستخدمة هنا هي خلايا neural precore من نوع Eton and a half.

تم فصل الخلايا بشكل حاد من القشور القشرية الجنينية. وقد تم استزراعها لبضعة أيام في أوساط زراعة خلوية. لقد قمت بإخراج الخلايا من الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

هذا البروتوكول مخصص للخلايا الملتصقة. وقد تم تنمية هذه الخلايا على أطباق ذات 0.4 بئر معالجة لزراعة الأنسجة ومطلية بـ PDL واللامينات. سأقوم الآن باستخدام خرطوم شفط للتخلص من الوسط الغذائي.

والخطوة التالية هي إضافة حوالي 500 µL من محلول PBS الخاص بـ dep SEA. ومرة أخرى، نريد استخدام رؤوس ماصات ذات مرشحات. أما محلول PBS، فوظيفته الأساسية هي غسل الوسط الزرعي.

لذا، يجب تجنب وصول أي من مكونات الوسط إلى عمود RNA أو التداخل مع عملية استخلاص RNA، وإلا فلن تحصل على إنتاجية جيدة. حسناً؟ سأقوم الآن بشفط محلول PBS بسرعة لأن الخلايا الجذعية العصبية لا تتحمل البقاء في PBS. الآن سأضيف 350 µL من محلول التحلل (lysis buffer) إلى كل منها.

حسناً، تأكد مجدداً من إضافة beta-mercaptoethanol إلى محلول التحلل (lysis buffer). الآن سأقوم بسحب ودفع محلول التحلل بالممصّة 15 مرة للتأكد من تحلل الخلايا، وذلك لنتمكن من استخراج محتويات الـ RNA.

سأقوم الآن بإضافة إيثانول بتركيز 70% إلى كل بئر، وبعد إضافة 350 microliters من هذا الإيثانول بتركيز 70%، سأقوم بسحب السائل وإطلاقه (pipet up and down) في كل بئر 10 مرات. لقد قمت بعملية السحب والإطلاق 10 مرات لكل بئر. الآن سأضبط الماصة على أكثر من 700 microliters بما أن الحجم الإجمالي لكل بئر هو 700 microliters.

بعد ذلك، سأقوم بسحب السوائل التي تتجاوز 700 µL، ثم توزيعها في عمود RNA. وبعد إضافة محتويات العمود، سأنتقل إلى جهاز الطرد المركزي وأقوم بتدويره لمدة 30 ثانية بالسرعة القصوى. وبعد عملية الطرد المركزي الأولى للمحلل، سأتخلص من الراشح عن طريق صبه في حاوية فارغة.

أو ما يفعله البعض الآخر هو استخدام خرطوم شفط لسحب الرشاحة. بعد ذلك، ستقوم بإضافة 700 µL من محلول غسيل منخفض الصرامة، وتأكد مجدداً من إضافة الإيثانول إليه.

سأقوم الآن بطردها مركزياً لمدة 30 ثانية بالسرعة القصوى. وبعد طرد محلول الغسل منخفض الصرامة مركزياً، سأتخلص من الراشح. حسناً؟ بعد ذلك، سأقوم بتحضير محلول الـ DNA.

لذلك، ستقوم بإضافة 5 µL من الـ DNA لكل عينة. وبالنسبة لنا، نقوم فعلياً بتقسيم الـ DNA إلى حصص صغيرة قبل البدء في هذه العملية، وذلك لأن المادة المستخدمة هي إنزيم.

من الأفضل تخزينها على شكل حصص صغيرة (aliquots). فإذا تم تخزينها ككمية واحدة، فإن عمليات التجميد والإذابة ستؤدي إلى تدمير النشاط الإنزيمي. لذا، بعد إضافة 5 µL من الـ DNAs، سأقوم بتخفيفها باستخدام 75 µL من محلول تخفيف الـ DNA.

بعد إضافة ذلك، سيكون الحجم الإجمالي 80 µL من محلول DNA. سأقوم الآن بإضافة 80 µL من محلول DNA إلى كل عينة. تأكد من وصول السائل إلى غشاء العمود.

لذا، فأنت تريد أن يمتص الغشاء محلول DNA، وبذلك ستتخلص من DNA، مما سيؤدي إلى زيادة حصيلة RNA.

بعد إضافة الـ DNAs، اترك العمود لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للإنزيم بأداء عمله. ومرة أخرى، ستقوم بتحضينه لمدة 15 دقيقة. حسناً، لقد انتهى الوقت.

بعد فترة تحضين لمدة 15 دقيقة، سأنتقل إلى جهاز الطرد المركزي لترسيب الـ DNAs لمدة 30 ثانية بأقصى سرعة. حسناً، بعد الدوران لمدة 30 ثانية للتخلص من الـ DNAs، سأقوم بالتخلص من الرشاحة. الآن سأضيف 700 µL من محلول منظم عالي الصرامة لغسل أي DNAs متبقية.

وبعد إضافة ذلك، سأقوم بالتدوير مرة أخرى لمدة 30 ثانية في جهاز الطرد المركزي. وبعد التدوير، سأتخلص من الراشح عالي الصرامة عن طريق صبه في وعاء. ثم سنضيف 700 µL من منظم الصرامة المنخفضة.

سأقوم هذه المرة بالدوران لمدة دقيقة واحدة بالسرعة القصوى في جهاز Centri Beach. وبعد غسلة التطهير المنخفضة الأولى لمدة دقيقة واحدة، سأقوم بالتخلص من الراشح. وفي هذه المرة لن أضيف أي شيء، بل سأقوم بالدوران مرة أخرى لمدة دقيقتين إضافيتين للتخلص من بقايا محلول التطهير المنخفض، لأن محلول التطهير المنخفض يحتوي على بعض الإيثانول، وهو ما قد يقلل من محصول RNA.

سأقوم الآن بإخراج محلول الاستخلاص (elu buffer) من وحدة التسخين المضبوطة على 70 درجة مئوية. فقط للتذكير، تأكد قبل بدء التجربة من وضع محلول الاستخلاص في درجة حرارة 70 درجة مئوية، ونريد الحفاظ عليه دافئاً لأن ذلك سيزيد من كفاءة حصيلة الـ RNA. لقد قمت بتجهيز الأعمدة.

لقد تم إخراجها في جهاز الطرد المركزي. لذا، في الخطوات التالية، يتم إخراج الأعمدة. حسناً، سأقوم بالتخلص من أنابيب الأغطية وسنقوم بنقلها إلى أنابيب الجمع هذه.

سوف تقوم بإضافة 50 µL من محلول Lucian المنظم إلى كل عمود. تأكد من وضع المحلول المنظم على الغشاء لضمان تشربه بشكل جيد؛ فإذا لم يحدث ذلك، لن تحصل على مردود جيد من الـ RNA.

الآن، تترك العمود لمدة دقيقة أو دقيقتين للتأكد من أن المحلول يتغلغل في غشاء العمود. حسناً، لقد مرت دقيقة الآن. يمكنني الآن نقله إلى جهاز الطرد المركزي.

سأقوم الآن بوضع الأعمدة في جهاز الطرد المركزي. سأقوم بتدويرها لمدة دقيقة واحدة بالسرعة القصوى. وهذه هي خطوة الطرد المركزي الأخيرة، والتي ستقوم من خلالها بجمع المادة الملوثة المستخلصة أو الـ RNA في هذه الأنابيب ذات الأغطية.

الآن، بعد عملية الطرد المركزي الأخيرة، أخرج المحتويات، وقم بإزالة العمود، ويمكنك التخلص منه، ثم أغلق الأنبوب، والآن يمكنك تخزينها في درجة حرارة -80، ويمكنك القيام بما تريده بها لاحقاً. لقد قمت للتو باستخلاص RNA باستخدام طقم BioRad RNA. سأقوم الآن بقياس تركيز RNA الذي استخلصناه، أو يمكننا قراءة الكثافة الضوئية (OD) له باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

إليك ما سأقوم بعرضه. أولاً، يجب علينا تحضير مزيج التخفيف، حيث سيكون التخفيف بنسبة 1 إلى 5.

سنقوم بخلط الـ RNA مع ماء مقطر عالي النقاء. لذا، سأقوم أولاً بتحضير عينة فارغة (blank)؛ سآخذ 2 µL من محلول الاستخلاص (elution solution) الذي استخدمناه لاستخلاص الـ RNA في البداية، ثم سأضيف 8 µL من الماء المقطر. حسناً؟

هذه هي العينة الفارغة. والآن سأقوم بتحضير العينة، حيث سأستخدم 2 µL من الـ RNA المستهدف.

سنقوم بإضافة ثمانية ميكرولترات من مياه MQ مرة أخرى، وبذلك يصبح التخفيف بنسبة 1 إلى 5، صحيح؟ لدي هذه الخلية الزجاجية حيث سأضع عيناتي، ثم سأقوم بتحميل هذه الخلية في جهاز المطياف.

دعونا ننتقل الآن لقياس ذلك. قبل قياس الكثافة الضوئية (OD) لعينات الـ RNA، سيتعين عليّ تنظيف الكيوفيت. إليكم هنا الكيوفيت الزجاجي.

يجب ألا تلمس الجزء الأمامي منه على الإطلاق؛ لأن ذلك سيترك بصمات عليه مما يؤدي إلى الحصول على قياسات خاطئة. لذا، ما سأفعله أولاً هو غسل مفتاح الزجاج باستخدام الماء المقطر مزدوجاً double DI water.

بعد ذلك، سأستخدم خرطوم تفريغ لسحب المياه. وبعد عملية الغسل هذه، سأقوم بغسله بـ 95% ethanol، ثم سأستخدم خرطوم التفريغ مرة أخرى لإزالة الـ ethanol.

أنا الآن مستعدة لتحميل العينة الفارغة (blank). لذا نحتاج إلى العينة الفارغة أولاً من أجل معايرة قراءاتنا. سأقوم بسحب 10 µL من المزيج الذي أعددناه للتو.

سأقوم الآن بخلط المحلول صعوداً وهبوطاً للحصول على مزيج متجانس. سأقوم بنقله إلى مقياس الطيف الضوئي هذا، وهو جهاز Ultra Spec 3, 100 probe، وسنقوم بقياس تركيز RNA.

لذا، افتح الجهاز، وسأضعه في أحد هذه الحوامل. سنقوم بضبط البرامج بحيث تتم قراءة RNA فقط. حسناً، مرة أخرى، لقد أجرينا تخفيفاً بنسبة 1 إلى 5.

لذا، نريد ضبط عامل التخفيف على خمسة. حسنًا، أنا مستعد الآن. سأقوم بالضغط على زر التشغيل (run) لإجراء مرجع للعينة الفارغة (blank).

حسنًا، لقد تم تصفير الجهاز الآن. لذا نحن مستعدون الآن لقياس عينتنا. سأقوم الآن بإخراج قاعدة المفتاح الزجاجية.

سأقوم بشفط محتويات العينة الفارغة. مرة أخرى، سأقوم بغسلها بماء DI مزدوج التقطير. ثم سأقوم بغسلها بـ 9 5%ethanol.

أنا الآن مستعدة لتحميل 10 µL من العينة المطلوبة. لذا، تأكد مجدداً من خلط العينة جيداً قبل تحميلها في الوعاء الزجاجي.

نحن الآن مستعدون للقراءة. بعد قياس الكثافة الضوئية (od)، يجب أن تكون نسبة نقاء الحصيلة الجيدة من RNA في نسبة امتصاص تتراوح بين 2.60 إلى 2.80، وتكون بحدود 2. أما الحصيلة فهي حوالي 144 µg/mL.

على الرغم من أن الجهاز يشير إلى 72 micrograms per mil، إلا أنه يجب علينا ضرب هذه القيمة في اثنين بسبب نصف الطول في العينات لدينا، حيث أظهرت سنتيمتران كيفية استخلاص RNA من الخلايا العصبية السلفية. ومرة أخرى، نحن نستخدم total mini RNA kit من BioRad؛ فقد جربنا مجموعات استخلاص أخرى وكانت هذه هي المجموعة الأفضل التي استخدمناها بناءً على كفاءتها.

يؤدي ذلك إلى الحصول على RNA بجودة عالية. إذا استخدمت هذه المجموعة، فستحصل على نفس النتائج عالية الجودة التي نحصل عليها دائمًا.