بصري تسجيل النشاط العصبي للقرار suprathreshold وحيدة الخلية واحد مسمار-

الهدف العام لتجربة FollowMe هو تسجيل نشاط الارتفاع العصبي من عدد كبير من الخلايا العصبية. يتم تحقيق ذلك من خلال ملاحظة الزيادة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا في سوما الخلايا العصبية المرتبطة بكل جهد فعل باستخدام المجهر الفلوري في الخطوة الأولى. يتم استخدام اثنين من إثارة الفوتون ومبدأ مسح الوصول العشوائي لتسجيل إشارات فلورسنت الكالسيوم من 40 خلية عصبية سوماتو بدقة مكانية وزمانية عالية.

في الخطوة الثانية ، يتم استخراج توقيت الارتفاع الدقيق من إشارات الفلورسنت باستخدام خوارزمية التفكك. يمكن استخدام هذه التقنية لتسجيل نشاط الارتفاع من عشرات الخلايا العصبية. يمكن بعد ذلك استخدام البيانات المتصاعدة لقياس المعلومات المتبادلة أو انتشار الإشارات بين مجموعات الخلايا العصبية أو الارتباطات العصبية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تسجيلات الأقطاب الكهربائية الدقيقة ، هي أنه يمكن للمرء تسجيل نشاط ارتفاع الخلايا العصبية من عدد كبير من الخلايا العصبية من السكان المحليين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الوظيفة القشرية على مستوى الشبكات المحلية للخلايا العصبية ، مثل أهمية الارتباطات التي تبحث عن المعلومات والتغيرات في ديناميكيات الشبكات مع لدونة القشرة لإثارة الفوتونين ، يتم استخدام نظام ليزر نبضي بالأشعة تحت الحمراء مع نبضات فيمتو ثانية. مطلوب طاقة خرج ليزر عالية لتعويض الخسائر الكبيرة التي تسببها المكونات البصرية للنظام.

يضفي الواعظ لكل نظام يتكون من منشورين تشتت سرعة مجموعة سالبة على نبضات الليزر قبل العاكسات البصرية للتعويض عن التشتت الزمني الذي أدخلته AODs اثنان من AODs بفتحات كبيرة يحرف شعاع الليزر في بعدين. يتم وضع درجات حيود عاكسة ب 100 أخدود لكل ملليمتر على بعد 13 سم خلف AODs لتعويض التشتت المكاني الذي أدخلته AODs. عند استخدام نبضات الليزر القصيرة ، يتم توجيه شعاع الليزر باستخدام تلسكوبين مرحلين إلى منفذ الكاميرا في المجهر المستقيم.

يتم وضع القزحية على فترات منتظمة لمحاذاة المكونات البصرية. ينقل مقسم الشعاع ثنائي اللون أمام الهدف ضوء الإثارة بالأشعة تحت الحمراء إلى العينة ويعكس ضوء التألق من العينة إلى الكاشف. تجمع كاشفات التألق الموسع وعبر التألق إشارة التألق من خلال الهدف ويتم وضع مرشحات الزجاج الملون للمكثف أمام أجهزة الكشف لمنع ضوء الإثارة من الوصول إلى أجهزة الكشف.

يتم التحكم في زوايا انحراف A OD بواسطة جهاز كمبيوتر مزود بلوحة تحويل تناظرية رقمية ، والتي بدورها تدفع مذبذبات التحكم في الجهد. يتم ترحيل الإشارة من مضاعفات الصور من خلال مرشح بتروورث منخفض التمرير بتردد قطع يبلغ 100 كيلو هرتز ويتم رقمنتها بواسطة محول رقمي تناظري بمعدل ساعة 156.25 كيلو هرتز قبل تخزينها على جهاز كمبيوتر للتحليل والمحاذاة ويتم اختبار الضوضاء الكهربائية عن طريق تسجيل توزيع إشارات الفلورسنت مع وبدون ضوء الليزر عند كسب منخفض ومرتفع لمضاعفات الصور ، وكذلك مع وبدون مؤشر ، يعتمد مسح الوصول العشوائي المتردد على الكشف عن الزيادات داخل الخلايا في الكالسيوم. تتمثل الخطوة الأولى في البروتوكول في تلطيخ عدد كبير من الخلايا العصبية بشكل إستر لمؤشر الكالسيوم عن طريق حقن البلعة.

بعد ذلك ، سجل نشاط سوما في كل خلية عصبية في أربعة مواقع لمدة 6.4 ميكروثانية في كل موقع. لتحديد الخلايا العصبية ذات الأهمية ، احصل على إطار كامل يتكون من 256 × 256 بكسل. ثم حدد يدويا مراكز الخلايا العصبية المراد تسجيلها داخل هذه الصورة.

تتم إضافة ثلاث نقاط على مسافة ميكرون حول كل مركز تلقائيا بواسطة برنامج التحكم في كل دورة. يتم تسجيل إشارة الفلورسنت من المواقع الأربعة في جميع الخلايا العصبية الأربعين. يتطلب التسجيل من جميع الخلايا العصبية في دورة واحدة 1.536 مللي ثانية.

كرر هذا التسجيل المتسلسل لجميع الخلايا العصبية ال 40 لمدة خمس ثوان. يعتمد اكتشاف السنبلة من إشارات الكالسيوم الجسدية الفلورية على نسبة إشارة عالية إلى الضوضاء. يمكن تحقيق نسبة إشارة عالية إلى ضوضاء عن طريق زيادة شدة الإثارة.

ومع ذلك ، لا يمكن زيادة شدة الإثارة إلا إلى حد معين بسبب تلف الصورة. لا يوجد سوى نافذة صغيرة جدا من شدة الإثارة حيث يكون تلف الصورة منخفضا وتكون نسبة الإشارة إلى الضوضاء كافية لاكتشاف المسامير الفردية من أجل التأكد من أن الإشارات المسجلة تقع ضمن نافذة اكتشاف الارتفاع العالي. أثناء التجربة ، يتم استخدام عدد من برامج التحليل عبر الإنترنت التي طورها مختبرنا.

بعد ذلك ، احسب معدل الفوتون التقريبي لكل خلية عصبية من نافذة زمنية قصيرة لضوضاء خط الأساس من حوالي 100 إلى 200 مللي ثانية. يتم حساب عدد الفوتونات ومعدل الفوتون من قيم التألق من خلال ملاءمة توزيع التغيرات الفلورية النسبية مع هذه المعادلة ، ثم حساب مضان خط الأساس من نفس النافذة الزمنية ورسمه كدالة للوقت أو التجارب. حافظ على متوسط انخفاض خط الأساس أقل من 0.0002 في الثانية عن طريق ضبط طاقة الليزر.

لأن اكتشاف السنبلة ينخفض بسرعة عند تجاوز هذا الحد. بعد ذلك ، تحقق من المواضع الجسدية للخلايا العصبية كل 10 إلى 20 دقيقة من خلال الحصول على صورة كاملة الإطار. اضبط مواقع التسجيل إذا لزم الأمر.

غالبا ما تأكل إشارات الفلورسنت الناتجة عن النشاط العصبي في الوقت المناسب بسبب الاضمحلال الطويل للكالسيوم العابر. في هذا الإجراء ، يتم استخدام طريقة التفكيك للارتفاعات وتوقيت الارتفاع من إشارات الفلورسنت. نستخدم هنا خوارزمية وراثية لتحديد نموذج قطار السنبلة الأكثر احتمالا الذي يناسب إشارة الفلورسنت المسجلة.

مع كل تكرار للخوارزمية ، يقترب الاحتمال الأقصى بشكل مقارب من الحد الأقصى الذي يعطى من ضوضاء تسجيلات التألق. في المجموعات المتجانسة من الخلايا العصبية ، يمكن أن تختلف إشارة الكالسيوم التي أثارتها السنبلة بين الخلايا العصبية. للتحليل غير الخاضع للإشراف لمجموعات البيانات الكبيرة ، قمنا بتصميم خوارزمية تأخذ في الاعتبار تباين إشارة الكالسيوم المستثرة من الخلايا العصبية إلى الخلايا العصبية لتجنب عدد كبير من الاكتشافات الإيجابية الخاطئة.

يتم تسجيل التوزيع المشترك للسعة وثابت وقت الاضمحلال لعابر الكالسيوم المستحث في سبايك واحد في مجموعة منفصلة من التجارب من نفس النوع من الخلايا العصبية في ظل نفس الظروف التجريبية. لحساب التغييرات الأساسية البطيئة وتقليل التكاليف الحسابية للفك ، يتم تقسيم التسجيلات الأطول إلى عدة آثار أقصر من ثانية إلى خمس ثانية لكل خلية عصبية في كل تسجيل ، وقد تختبر خوارزمية الالتفاف عددا كبيرا من النماذج تصل إلى 1 مليون نموذج مختلف أو أكثر لتسريع التفكيك ، يتم تعقيد تجربة واحدة على ما يصل إلى 10 أجهزة كمبيوتر مختلفة. في موازاة.

بعد التفكيك ، يتم تحليل بيانات السنبلة وفحصها. يتم حساب احتمال ارتفاع الرسم البياني لوقت التحفيز المحيط ومعدل إطلاق الخلايا العصبية بطريقة آلية. فيما يلي أمثلة على إشارة الفلورسنت المسجلة بمعدل إثارة منخفض جدا والأخرى بمعدل إثارة مرتفع جدا داخل نافذة الكشف.

لاحظ أن كل مثال يوضح الاستجابة لارتفاع واحد. يظهر هنا صورة مجهرية لشريحة دماغية حادة وماصتين تحفيزيتين موضوعتين في نفس العمود القشري. في الطبقة الرابعة ، تظهر هذه الاستجابات العصبية للمنبهات المتكررة ، ويوضح هذا الرسم البياني معلومات شانون المتبادلة التي تشير إليها مجموعة الخلايا العصبية المسجلة.

فيما يلي قياس انتشار نشاط ارتفاع العتبة الفائقة بين مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية القشرية. هذه هي المسامير المكتشفة في الخلايا العصبية القشرية ، استجابة للتحفيز الكهربائي للألياف القشرية. عند تسجيل النشاط العصبي باستخدام مسح الوصول العشوائي ، من المهم جدا التسجيل داخل نافذة الكشف.

خلاف ذلك ، من السهل جدا أن ينتهي بك الأمر بمجموعات بيانات غير قابلة للاستخدام. لا يزال الكشف عن السنبلة البصرية في مهده. هناك مجال كبير للتحسين.

مع بعض التحسينات ، نسجل من المزيد من الخلايا العصبية. مع التحسينات الأخرى ، سنكون قادرين على التسجيل في مستيقظة وتصرفة.