الوقت الفاصل بين التصوير للهجرة أرومة عصبية في شرائح الدماغ الأمامي الحاد للماوس الكبار

وصفنا بروتوكول للفي الوقت الحقيقي videoimaging للهجرة الخلايا العصبية في الدماغ الأمامي الماوس. وسجلت هجرة الخلايا العصبية السلائف فيروسي أو المطعمة التي تحمل علامات في حي شرائح واسعة باستخدام الحاد مجال التصوير الفلورسنت مع فاصل زمني سريع نسبيا اقتناء لدراسة المراحل المختلفة للهجرة الخلايا، بما في ذلك فترات من مراحل ثابتة والهجرة وسرعة الهجرة.

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة هجرة الخلايا العصبية في الشرائح الحادة من دماغ الفأر البالغ الأربعة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تسمية السلائف العصبية أولا في المنطقة تحت البطينية للبالغين بعد خمسة إلى ثمانية أيام من وضع العلامات على الخلايا العصبية ، وإعداد شرائح حادة من الفأر للدماغ. بعد ذلك ، يتم إجراء التصوير بفاصل زمني لهجرة الخلايا العصبية.

في نهاية المطاف ، يتم استخدام الفحص المجهري في الوقت الفعلي واسع النطاق لإظهار ديناميكيات هجرة الخلايا العصبية في الشرائح الحادة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال تطور الخلايا العصبية من خلال دراسة دور الإشارات الجزيئية المختلفة والآلية الخلوية التي تنطوي على هجرة الخلايا. الآن يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للعمليات الفسيولوجية التي تنظم الهجرة العصبية لدى البالغين للدماغ ، ولكن يمكن تطبيقها أيضا في أنظمة أخرى مثل دراسة الهجرة العصبية في الدماغ الإقفاري وأثناء التطور الجنيني.

ابدأ هذا الإجراء بإعداد سائل نخاعي دماغي اصطناعي قائم على السكروز لتقطيع الشرائح و 32 درجة مئوية من كلوريد الصوديوم A CSF للحفاظ على الشرائح حتى التصوير ثم أكسجة المحاليل عن طريق فقاعاتها باستمرار بنسبة 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، قم بتخدير الفأر باستخدام الخلايا العصبية المسمى بالفلورسنت باستخدام الكيتامين زيلازين داخليا. ثم قم بإعداد محلول القطع المثلج بسرعة بمظهر يشبه الهلام باستخدام النيتروجين السائل.

بعد ذلك ، خذ ما يصل إلى 15 إلى 20 مل من محلول القطع المثلج البارد باستخدام حقنة 20 سم مكعب وقم ببث الماوس داخل كاردي. إذا كانت الأوعية الدموية بحاجة إلى وضع العلامات بدلا من التخلي عن محلول القطع ، فقم بحقن 200 ميكرولتر من ديكستران تكساس الأحمر بتركيز 10 ملليغرام لكل مليلتر ، ونقل كاردي إلى البطين الأيسر للقلب ، وانتظر دقيقتين إلى ثلاث دقائق قبل قطع رأس الفأر بعد نضح القلب العابر ، وقطع رأس الفأر بسرعة اغمر الرأس في محلول القطع المثلج البارد وانقله إلى الاهتزاز. قطع الجمجمة بالمقص على طول الخيط السهمي من المخيخ إلى البصلة الشمية.

بعد ذلك ، قم بإزالة اللوحات القحفية برفق باستخدام زوج من الملقط بعد ذلك ، قم باستئصال الجزء اللطيف من الدماغ باستخدام مشرط. ثم قم بعمل قطعتين سهميين على الجزء الجانبي من كل نصف كرة أرضية ، وقطع الدماغ على طول الشق داخل نصف الكرة الأرضية. ثم قم بإزالة الدماغ برفق باستخدام ملعقة وضعها في محلول القطع البارد المثلج.

ضع نصفي الكرة الأرضية بشكل منفصل على كتلة أجار بنسبة 4٪ مع ملامسة الجانب الظهري للأجار. بعد ذلك ، قم بلصق الكتلة مع الجانب المقطوع جانبيا من نصفي الكرة الأرضية على منصة Vibram بحيث يكون الجانب الإنسي متجها لأعلى. بعد ذلك ، ضع المنصة في غرفة Vibram.

املأها بمحلول القطع. ثم احتفظ بالمحلول مؤكسج طوال تحضير الشريحة عن طريق فقاعاته بنسبة 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. الآن قم بإعداد الأقسام التي يبلغ سمكها 250 ميكرون باستخدام الهزاز.

يجب استخدام سرعة قطع منخفضة واهتزاز شفرة عالي التردد للحصول على أقسام عالية الجودة. بمجرد تحرير شريحة من الشفرة ، قم بإزالتها برفق من محلول القطع وضعها في غرفة حضانة مملوءة ب A السائل الدماغي النخاعي المؤكسج المحفوظ عند 32 درجة مئوية في حمام مائي. في هذا الإجراء ، ضع الشريحة بعناية في غرفة التصوير بالمجهر لتجنب انجراف الشريحة أثناء التصوير.

قم بتثبيته عن طريق وضع شبكة من النايلون بعناية في الأعلى. تأكد من أن الشريحة ممتلئة باستمرار باستخدام CSF. بعد ذلك ، استخدم هدف 10 x للعثور على مجال الاهتمام.

افتح برنامج التحويل وتأكد من أن شبكة النايلون لا تعيق مجال التصوير. ثم قم بإشراك الهدف 40 × واضبط التركيز. تأكد من وجود حل كاف بين الهدف والشريحة.

باستخدام برنامج التحول ، قم بتعيين معلمات اكتساب الفاصل الزمني ، مثل مدة الإثارة ، وعدد مستويات Z ، والمسافة بين كل قسم Z ، والفاصل الزمني ، ومدة التسجيل. ثم ابدأ الحصول على الفاصل الزمني. يتم حفظ البيانات تلقائيا بواسطة Metamorph كملف tiff مع كل ملف يتوافق مع نقطة زمنية واحدة لفيديو الفاصل الزمني المكتسب لفتح الفيلم في Mrs.Load

الصور المكتسبة ببساطة عن طريق سحب وإفلات صورة النقطة الزمنية الأولى للفيديو في أيقونة البرنامج. بمجرد تحميل الفيلم ، اضبط سطوع الإشارة وتباينها في نافذة ضبط الشاشة. قم بتعيين معلمات الفيديو المكتسب ، مثل حجم voxel والفاصل الزمني في خصائص الصورة ، وقم بتعيين نوافذ النقاط الزمنية المتساوية البعد.

بعد تحديد حجم فوكسل ، من الممكن رؤية الإطار في 3D بالإضافة إلى وقت وحجم الفيديو لتتبع الخلايا المسجلة تلقائيا. قم بإنشاء مكان لكل خلية في الحقل في نافذة التجاوز عن طريق اختيار وظيفة البقع ، وقم بقياس قطر الخلية المراد تتبعها في نافذة الشريحة. قم بتعيين معلمات التتبع والمتابعة.

افحص موثوقية الكائنات المكتشفة بمرور الوقت. إذا لم يتم اكتشاف جميع الخلايا التي تم ترحيلها تلقائيا، فقم بتغيير حد الاكتشاف وتأكد من تحديد جميع الخلايا مع النقاط في جميع النقاط الزمنية. يجب تحديد الحد الأقصى للمسافة والحد الأقصى لحجم الفجوة بين نقطتين تمثلان نقاطا زمنية متجاورة لنفس المسار حتى يتمكن البرنامج من توصيل النقاط الزمنية.

بمجرد إنشاء المسارات ، من الممكن تصفيتها وإزالة المسارات غير ذات الصلة ببساطة عن طريق حذفها. يمكن تصحيح المسارات عن طريق توصيل وفصل مسارات مختلفة ونقاط زمنية مختلفة لنفس المسار بمجرد إجراء جميع التصحيحات. ألق نظرة أخيرة على المسارات وقم بتصدير البيانات ، بما في ذلك إزاحة الخلية لكل نقطة زمنية ، وطول المسار ، وطول الإزاحة ، ومدة التتبع إلى ملف Excel.

يظهر هذا الفيديو تصوير الفاصل الزمني لهجرة الخلايا العصبية الخضراء على طول ديكستران ، الأوعية الدموية ذات العلامات الحمراء في تكساس. لاحظ أن الخلايا العصبية المهاجرة تظهر سلوكا مملحا عندما تنقطع مراحل الهجرة بفترات ثابتة. ويظهر هذا الفيديو تتبع هجرة الخلايا العصبية بواسطة برنامج imas.

تشير الكرات والخطوط إلى أجسام الخلايا ومسارات الهجرة للخلايا الفردية على التوالي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يجب الحصول على شرائح حياة حادة ذات نوعية جيدة من الدماغ الأمامي للفأر البالغ. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تثبيت الشرائح جيدا في غرفة التصوير عن طريق وضع شبكة من النايلون بعناية لتجنب انجراف الشريحة أثناء التصوير.

يمكن أن تتسبب أي تغييرات في معدل نضح السائل الدماغي النخاعي أو التروية غير المنتظمة أو التباين الجذري في درجة الحرارة في حدوث انجراف وتغيرات في المستوى البؤري أثناء التصوير. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسجيل وتحليل هجرة الخلايا العصبية في الشرائح البالغة الحادة. نوصي باستخدام فاصل قصير للطبيب في حدود 15 إلى 30 ثانية لتحديد بداية ونهاية مرحلتي الهجرة والثابتة بشكل موثوق.