تلطيخ بروتوكولات لجزر البنكرياس الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف جزر البنكرياس البشرية باستخدام صبغتي الهيماتوكيسيلين والإيوزين والكيمياء النسيجية المناعية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد مقاطع متسلسلة من عينة بنكرياس مدمجة في قالب بارافيني، ثم توضع هذه المقاطع على شرائح مجهرية مع الحفاظ على اتجاهها الأصلي.

يتم صبغ جزء من الشرائح بالهماتوكيسلين والإيوسين، بينما تُصبغ الشرائح المتبقية باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية، وتتمثل الخطوة النهائية في مسح الشرائح المصبوغة ضوئيًا وتنظيمها حسب كل حالة. وفي النهاية، يمكن رفع هذه الصور إلى قاعدة بيانات علم الأمراض عبر الإنترنت حيث يمكن لباحثين آخرين في هذا المجال الاطلاع عليها. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أن الشرائح تُصبغ في سلسلة مع الحفاظ على توجيهها الأصلي.

ستقوم كل من ليندا سنايدر، أخصائية تقنيات الأنسجة، وإيميلي مونتغمري، العالمة البيولوجية، وتيفاني هيبو، فنية المختبر في مختبري، باستعراض هذا الإجراء. للبدء، قم بتجهيز الحمام المائي والميكروتوم باتباع الإجراءات القياسية للتقطيع الميكروتومي لبارافين. بعد ذلك، ضع ملصقات على الشرائح ذات الشحنة الموجبة تتضمن رقم الحالة، ومنطقة البنكرياس، ورقم الشريحة.

بمجرد تجهيز كل شيء، ضع قالب البارافين في حامل الميكروتوم بحيث يكون ملصق الكاسيت على الجانب الأيسر. باتباع إجراءات التقطيع الميكروتومي المعتادة، قم بتقطيع القالب حتى يظهر النسيج بشكل موحد. وبمجرد الوصول إلى النسيج بالتساوي، استخرج شريطاً من المقاطع المتسلسلة بسمك حوالي أربعة ميكرون.

تتطلب العملية من ثلاثة إلى ستة مقاطع، اعتمادًا على عدد الصبغات الأولية المطلوبة. بعد ذلك، افصل مقاطع الشريط. ثم التقط كل مقطع بالترتيب وضعه على شريحة.

سجل رقم المقطع باستخدام قلم رصاص. إذا كان المقطع غير صالح للاستخدام، فتخطَّ هذا الرقم واستمر في ترقيم المقاطع بالترتيب الدقيق. احرص على الحفاظ على نفس اتجاه الشريحة كما كانت في الكاسيت، مع توجيه ملصق الشريحة نحو اليسار.

بعد ذلك، ضع الشرائح في حامل شرائح واتركها تجف طوال الليل. وفي درجة حرارة الغرفة، أعد سد سطح قالب البارافين بطبقة رقيقة من البارافين للحفاظ على النسيج، ثم قم بأرشفته في درجة حرارة الغرفة أو عند -20 درجة مئوية. كرر هذا الإجراء مع العينة التالية.

من المهم الحفاظ على ترقيم المقاطع المتسلسلة عند كل مستوى كما هو موضح أعلاه بالنسبة لصبغة الـ h and e. ضع الشريحة الأولى من كل كتلة في حامل شرائح، ثم ضع الحامل في الحوض الأول من جهاز التلوين التلقائي. اختر برنامج HE القياسي وابدأ عملية التلوين.

عند الانتهاء من عملية التلوين، أخرج الشرائح من جهاز التلوين التلقائي وضعها داخل خزانة التدفق الصفائحي (الغطاء) لتغطيتها. ضع غطاءً زجاجياً على كل شريحة باستخدام التقنيات القياسية. وأخيراً، ضع ملصقاً مطبوعاً على الشرائح واتركها تجف تماماً داخل خزانة التدفق الصفائحي.

ابدأ بتجهيز جهاز الصبغ الآلي وتحضير جميع الكواشف اللازمة. اختر برنامج Daco للصبغات المزدوجة. أدخل عدد الشرائح والمعالجة التي ستتلقاها كل شريحة.

قم بتحميل جميع الكواشف في جهاز التلوين التلقائي وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة. بعد ذلك، قم بتحضير منظمات TBST والسترات، والأجسام المضادة، والكواشف الأخرى المطلوبة للإجراء. قم بإزالة البارافين من الشرائح بوضعها في الزايلين لمدة خمس دقائق.

لا تسمح للشرائح بأن تجف، لأن ذلك سيؤدي إلى زيادة تلوين الخلفية والمسام أثناء عملية إزالة البرافين (deparaffinization). صب منظم السترات في جهاز التبخير لتسخينه مسبقاً قبل الاستخدام. بعد ذلك، أخضع الشرائح التي تمت إزالة البرافين منها لسلسلة من غسلات الإيثانول.

اشطف الشرائح مرة أخيرة بالماء منزوع الأيونات. أضف الشرائح إلى محلول سترات منظم مسخن مسبقاً واتركها تتبخر لمدة 30 دقيقة. بعد هذه الفترة، انقل الشرائح فوراً إلى حمام مائي في درجة حرارة الغرفة حتى تبرد تماماً.

بمجرد أن تبرد، انقل الشرائح إلى رفوف جهاز صبغ Dayco التلقائي، مع الحرص على الحفاظ على التسلسل الصحيح. وأخيراً، قم بتشغيل برنامج الصبغ المزدوج الذي تم تحميله مسبقاً. وعند اكتمال برنامج الصبغ المزدوج، أخرج الشرائح من جهاز الصبغ التلقائي واتركها لتجف لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل عملية نزع الماء.

لمواصلة عملية إزالة المياه، انقلهما إلى إيثانول بتركيز 80% لمدة دقيقة واحدة. استمر في إزالة المياه من الشرائح عن طريق نقعها في إيثانول بتركيز 95% ثم 100% في النهاية. وأخيرًا، اغمس الشرائح وثبتها في الزيلين لمدة دقيقة واحدة.

قم بتثبيت الشرائح فوراً باستخدام أغطية الشرائح ومادة cyto seal لإتمام الإجراء. اطبع الملصقات التي تحتوي على معلومات الحالة، بما في ذلك العضو ورقم القطعة، ونوع الصبغة والتاريخ. ضع ملصقاً على كل شريحة لمسح شرائح الصبغ ضوئياً.

ضعها على صينية الماسح الضوئي واتبع الإجراءات القياسية. يتم أرشفة الشرائح المصبوغة في درجة حرارة الغرفة، وأي شرائح متبقية غير مصبوغة عند -20 °C للاستخدام المستقبلي. وأخيراً، قم بتنظيم الصور المصبوغة حسب المتبرع ونوع النسيج المرئي.

إليك مثال على صبغ KI 67 مع الإنسولين عند مستويين من التكبير، منخفض وعالٍ. يتم إرسال صور المقاطع البنكرياسية المصبوغة إلى قاعدة بيانات باثولوجية عبر الإنترنت لإنشاء بنك حيوي افتراضي. وباستخدام قاعدة البيانات هذه، يمكن للباحثين الوصول سريعاً إلى المعلومات اللازمة لأبحاث مرض السكري من النوع الأول.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تحضير وصبغ شرائح عالية الجودة من البنكرياس البشري.