إعداد شرائح الحاد المنطقة Subventricular للتصوير الكالسيوم

ووصف طريقة لتحميل subventricular منطقة (SVZ) الخلايا مع الأصباغ الكالسيوم مؤشر لنشاط الكالسيوم التسجيل. وSVZ بعد الولادة يحتوي على خلايا معبأة بإحكام بما في ذلك الخلايا العصبية والسلف neuroblasts. بدلا من استخدام حمام التحميل حقن الصبغة عن طريق فإننا الضغط داخل الأنسجة مما يسمح نشر أفضل صباغة.

الهدف من هذا الإجراء هو تصوير نشاط الكالسيوم للخلايا في المنطقة تحت البطينين بعد الولادة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة أنسجة المخ بعناية من فأر ما بعد الولادة. الخطوة الثانية هي عمل شرائح دماغ حادة حية تحتوي على المنطقة تحت البطينية.

بعد ذلك ، يتم تحميل شرائح الدماغ بصبغة حساسة للكالسيوم. الخطوة الأخيرة هي تصوير النشاط باستخدام مجهر متحد البؤر بفاصل زمني. في النهاية ، يتم استخدام التصوير بفاصل زمني لنشاط الكالسيوم في خلايا منطقة البطين لإظهار ديناميكيات النشاط بين الخلايا للكشف عن أنماط الاتصال بين أنواع الخلايا المختلفة والأوعية الدموية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تكوين الخلايا العصبية ، مثل كيفية تواصل أنواع الخلايا المختلفة مع بعضها البعض ، وكيف يمكن للخلايا أن تؤثر على الأوعية الدموية بعد التضحية بجرو فأر P 20 إلى P 30 وقطع رأسه. وفقا للإرشادات المعتمدة مؤسسيا ، ضع الرأس في حقل صينية بمحلول تشريح. قم بتثبيت الرأس بالملقط واستخدم مقصا صغيرا لإجراء جروح مستمرة حول الجمجمة وخط الوسط.

تأكد من أن البصلة الشمية تظل ملتصقة بالدماغ وعدم تلفها. قم بعمل جروح على الجانب الظهري ثم استخدم الملقط لإزالة الجمجمة العلوية من الدماغ. بعد ذلك ، مع الاستمرار في إمساك الرأس بالملقط ، استخدم شفرة جراحية لعمل قطع إكليلي على مستوى لامدا.

استخدم نفس شفرة الحلاقة لعمل جروح سهمية على جانبي الدماغ حوالي ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات جانبية لخط الوسط. ثم استخدم الشفرة لغرف أسفل الدماغ وإزالتها تماما من الجمجمة. يجب أن يتم الإجراء حتى هذه النقطة في أقل من ثلاث دقائق.

ضع القليل من الغراء الفائق القائم على السيانوا أكريليت على لوحة الاهتزاز. ثم التقط أنسجة المخ وقم بتثبيتها على أحد الجوانب المسطحة الناتجة عن القطع السهمي الجانبي. يعد تركيب كتلة الاغاروز لتثبيت الأنسجة أثناء القطع أمرا اختياريا.

اشطف شفرة الاهتزاز بالإيثانول لإزالة الزيوت ثم اشطفها بالماء المقطر. ضع الشفرة في حامل الشفرة وقم بتركيب حامل الشفرة على الهزاز. اضبط الهزاز بحيث يتم قطع شرائح الأنسجة بسمك 250 إلى 350 ميكرون عند اهتزاز عالي التردد وسرعة منخفضة تدريجيا عبر الأنسجة.

يعد ظهور البصلة الشمية مؤشرا جيدا على أن الأقسام السهمية تقترب من المنطقة تحت البطينية. يعد ظهور البطينين وسماكة الجسم الثفني أيضا مؤشرات جيدة على الظهور اللاحق للمنطقة تحت البطينية. بمجرد الوصول إلى المنطقة تحت البطينية ، استخدم ماصة معكرونة بلاستيكية مع قطع الطرف لإزالة كل شريحة ونقلها إلى حجرة تثبيت الشريحة.

مع السائل الدماغي النخاعي. تتطلب الشرائح ساعة واحدة من الحضانة في السائل الدماغي النخاعي. خلال هذا الوقت ، يمكن تحضير الماصات والصبغة والمجهر لخطوات التصوير اللاحقة.

لتحضير الماصات، اسحب ستة إلى ثماني ماصات زجاجية بحيث يبلغ طول طرف كل منها حوالي ملليمترين وقطرها من اثنين إلى ثلاثة ميكرون. بالإضافة إلى ذلك، يتم ضبط حامل الماصة مسبقا بزاوية حوالي 16 درجة بحيث يمكن تركيب الماصة دون ملامسة غرفة التروية أو التدخل في وضع الهدف. لتحضير صبغة الكالسيوم ، أضف 4.6 ميكرولتر من محلول F1 27 ، 20٪ في DMSO إلى 50 ميكروغرام من الأنفلونزا أوه أربعة.

أخيرا ، لإعداد المضخة التمعجية ، التي يساعد استخدامها على تقليل انحراف الصورة ، قم بتشغيل السائل الدماغي النخاعي عبر خطوط التروية وتأكد من أن الخطوط خالية من الفقاعات. الآن ، ضع طرف الفراغ للتأكد من أن المحلول يتم شفطه من غرفة التروية. توضح هذه الصورة إعداد نظام التروية.

يجب أن يكون الحل على مستوى مناسب لغمر الهدف على مسافة العمل المناسبة ، ولكن ليس مرتفعا بحيث ينسكب المحلول على جوانب الغرفة. استمع إلى الثبات للتحقق من الطموح المستمر لتطبيق صبغة التحميل عبر طريقة الاستحمام. أولا ، اصنع ملليلترا إلى ملليلترين من محلول عمل الصبغة المكون من أربعة إلى خمسة ميكرومولار عن طريق تخفيف محلول المخزون.

في السائل الدماغي النخاعي ، انقل الشرائح إلى طبق مزروع بحجم 35 ملم مع قاع شبكي مملوء ب CSF. استخدم ماصة نقل بلاستيكية سعة ثلاثة ملليلتر لإزالة السائل النخاعي A برفق مع إضافة محلول عمل صبغة الكالسيوم في نفس الوقت. ثم احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة في بيئة يتم التحكم فيها بغاز ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.

بعد الحضانة ، ضع الشريحة مرة أخرى في غرفة الاحتجاز المملوءة بالسائل الدماغي النخاعي لغسل الصبغة التي لم تدخل الخلايا. بعد 30 دقيقة في السائل الدماغي النخاعي ، انقل الشريحة إلى غرفة التروية لتطبيق الصبغة بضغط. انقل شريحة من حجرة التثبيت إلى غرفة التروية على المجهر الذي تم إعداده.

ثم قم بإعادة ملء الماصة الزجاجية بمحلول عمل صبغة 250 ميكرومولار. تأكد من خلو طرف الماصة من الفقاعات ووضعه على المعالج الدقيق. الآن اخفض الماصة إلى منطقة الاهتمام.

يمكن وضع الماصة بحيث يكون الطرف على ارتفاع السطح المقطع، أو دفنها عدة ميكرومترات تحت السطح، ولكن بعيدا عن المنطقة المسجلة. اضبط pico spritzer على توصيل أقل من ثلاثة أرطال لكل بوصة مربعة وقم بتطبيق الصبغة لمدة دقيقة إلى دقيقتين. قد يكون من الضروري استخدام الطلبات المتكررة اعتمادا على الملصقات كما تم تقييمها بالعين.

عند تطبيقه على سطح الشريحة ، سيقوم هذا البروتوكول بشكل تفضيلي بتسمية الخلايا العصبية عند تطبيقه تحت السطح ، وستقوم هذه التقنية بشكل تفضيلي بتسمية الخلايا النجمية ، ولكن إذا تم تطبيقها لأكثر من ثلاث دقائق بتركيز 500 ، تسمية الخلايا العصبية الدقيقة. بغض النظر عن موضع طرف الماصة، اترك الشريحة تغسل وتتعافى في السائل الدماغي النخاعي لمدة 30 إلى 45 دقيقة. حدد موقع المنطقة ذات الاهتمام بهدف الطاقة المنخفضة، ثم قم بالتبديل إلى هدف الغمر المائي ذي الطاقة الأعلى وقم بتقييم صحة الخلايا في المنطقة ذات الاهتمام.

في ظل تباين التداخل التفاضلي ، تظهر الخلايا السليمة مستديرة وممتلئة الجسم وتعرض أنفلونزا باهتة أوه أربعة تحميل. بعد التحقق من أن التروية والفراغ يعملان بشكل كاف ، قم بإعداد دقة الفاصل الزمني والدقة المكانية إلى المعدلات المطلوبة. في هذه الحالة ، يتم تصوير إطار واحد كل ثانية تقريبا بدقة خمسة 12 × خمسة 12 بكسل.

بعد تحديد مدة دقيقتين إلى 10 دقائق ، ابدأ الجري. يتم غسل العوامل الدوائية لمدة خمس إلى 10 دقائق ثم يتم غسلها لمدة خمس إلى 10 دقائق أخرى. تم التقاط متوسط الصورة الممثلة هذا من تسجيل بفاصل زمني للكالسيوم بعد الخلايا النجمية في المنطقة تحت البطينية.

كانت محملة بالضغط. تطبيق الأنفلونزا أوه 4:00 صباحا في عمق الشريحة. تم الحصول على الأفلام بسعر 0.5.

الخطوات الزمنية الثانية ، يتم وضع مناطق الاهتمام فوق الخلايا التي تظهر النشاط. فيما يلي الآثار من مناطق الاهتمام المرقمة الموضحة سابقا. تمت تصفية الآثار بمتوسط متحرك وتطبيعها.

يمثل المقياس الرأسي مرتين دلتا F على F صفر حيث F هي شدة الإشارة ، و F صفر هو متوسط إشارة خط الأساس ودلتا F تساوي F ناقص F صفر. بمجرد إتقانها. يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أربع إلى خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.