Name: تضخيم بروتين دوري Misfolding من البريونات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: اكتشف تقنية تضخيم البروتين المطوي بشكل دوري لدراسة تحول البريونات وتحديد سلالاتها في المختبر. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات أمراض البريونات وتطوير طرق الكشف عنها.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نشكر الدكتور نجمة المساء الحديد ماري راموس لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المركز الوطني لبحوث الموارد (P20 RR0115635-6، C06-01 RR17417 وG20RR024001) والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (2R01 NS052609).

1. إعداد معدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام Misonix 3000 أو 4000 Misonix sonicator (فارمنجديل، NY) متصلة حمام الحرارية Neslab الكترون EX-7 المياه (نوينغاتون، NH) للحفاظ على درجة حرارة ثابتة من 37 ° C. يصوتن العينات في 200 ميكرولتر رقيقة الجدران أنبوب PCR شرائط مع قبعات القبة تم الحصول عليها من العلم الحرارية (التايم، MA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> A sonicator العلامة التجارية الجديدة يتطلب &quot;كسر في&quot; فترة من التشغيل المستمر 9. فاصل في فترة شهرين وتتألف من انفجار صوتنة 40-ثوانى ودورات حضانة الدقيقة 10-مع مستوى السعة إلى 10 مجموعة. ينبغي للمرء أن يلاحظ تآكل في جميع أنحاء سطح صفيحة ميكروسكوبية القرن التيتانيوم (الشكل 1، لوحة B). فإن الماء عكر تعميم تبدو بيضاء بسبب تآكل صفيحة ميكروسكوبية القرن التيتانيوم. استبدال هذه المياه يوميا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والتضخيم من برأسية بي ار بي تختلف في جميع أنحاء منطقة القرن صفيحة ميكروسكوبية. ويمكن الحصول على أفضل التضخيم برأسية بي ار بي الكفاءة داخلدائرة نصف قطرها 5 سم من وسط القرن صفيحة ميكروسكوبية (انظر الشكل 1، لوحة C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جولة واحدة من دورات PMCA يتكون 144. كل دورة تتكون من صوتنة 5 و 10 ثانية حضانة دقيقة. وهذا يستتبع تقريبا إلى 24 ساعة لكل جولة من PMCA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتاج الطاقة من صوتنة، عرض على لوحة التحكم في sonicator، ويختلف مع عدد من الأنابيب PCR موجودة في رفوف وsonicator ودرجة حرارة المياه المتداولة من حمام الماء. تأكد من أن الماء هو معايرتها عند 37 درجة مئوية، وعدم ملء أكثر من 30٪ من رف أنبوب للsonicator في (الشكل 1، لوحة C). نشر أنابيب PCR خلال القرن صفيحة ميكروسكوبية. على الأقل صف واحد من المساحة الفارغة بين شرائح أنبوب PCR والسماح أي أكثر من أربعة أنابيب متصلة ببعضها البعض في قطاع (الشكل 1، لوحة C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قوة صوتنة أمر بالغ الأهمية لالتضخيم بريون سلالة ناجحة. بينما sonicating، ضبط السعة لانتاج الطاقةتتراوح ما بين 155 واط 170 ~. في مختبرنا تم تعيين مستوى السلطة إلى ستة وسبعة ل3000 Misonix وMisonix 4000، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الماء المقطر في حمام مائي لتفادي تراكم البقع الماء العسر. استبدال هذا الأسبوعية المياه. خلال دورات حضانة وصوتنة، وتكثيف الماء داخل الغطاء تحدث القرن صفيحة ميكروسكوبية. لتجنب التكثيف، إرفاق الحرارة الحوض الصغير لوحة إلى أعلى مربع الضميمة على sonicator كما هو موضح في الشكل 1، لوحة A. </li></ol> 2. إعداد عينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات عن طريق رعاية جامعة كريتون الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة والامتثال للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. مخزنة قبل أي جمع الأنسجة، ويجب أن يكون هذا الحيوان تخدير وperfused transcardially باستخدام الثلج الباردة الفوسفات محلول ملحي مع EDTA 5 مم في درجة الحموضة 7.4 لإزالة الدم من المخ وتجنب تثبيطPMCA رد فعل من الدم 7. جمع الأنسجة الحيوانية بسرعة باستخدام تقنية العقيم ولها أدوات تشريح مخصصة لكل سلالة بريون. بعد تشريح، ضع الأنسجة في أنبوب مل ميكروسنتريفوج 1.5، فلاش تجميده على الثلج الجاف، وتخزينها في -80 ° C حتى التجانس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد الركيزة PMCA (بي ار بي C) حل، والتجانس الدماغ الهامستر غير مصاب (UN BH) في التوصل إلى حل الوزن / الحجم (ث / ت) 10٪ مع العازلة الجليد الباردة تحويل (انظر الجزء 3) باستخدام طاحونة الأنسجة Tenbroeck. بينما المجانسة، يجب الحرص على عدم الحصول على طاحونة الهواء داخل لتجنب الإفراط في رغوة من الحل. توضيح الحل عن طريق الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 30 ثانية وقسامة طاف في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. المحل في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد البذرة PMCA (بي ار بي SC) الحل، التجانس مادة المعدية (الغدد الليمفاوية الدماغ والطحال و، الأنسجة الأخرى أو التربة الملوثة) إلى حل ث / ت 10٪ مع توفير المياه المثلجةص وقسامة الحل في 0.6 مل أنابيب microcentrifuge. المحل في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. </li></ol> 3. إعداد الاحتياطي التحويل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن 0.5093 غرام من تريتون X-100 في قارورة سعة 50 مل (النتيجة هي تركيز 1٪ تريتون X النهائية لل-100) (سيغما الدريخ شركة محدودة؛ Steinheim، ألمانيا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة واحد مثبط البروتياز كاملة اللوحي (روش تشخيص محدودة؛ مانهايم، ألمانيا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0،0931 غرام من EDTA (وهذا سوف يؤدي إلى تركيز النهائي 5 ملم EDTA من) (مالينكرودت بيكر وشركة؛ فيليبسبورغ، NJ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم 1N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخزين المؤقت ضبط مستوى الصوت إلى 50 مل مع الفوسفات في Dulbecco المالحة (DPBS) (Mediatech شركة؛ ماناساس، VA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية حل من خلال غشاء النيتروسليلوز 0،45 ميكرون مع فراغ جهاز الترشيح. ويمكن تخزين المخزن المؤقت في تحويل C ° 4 لمدة لا تزيد عن شهر واحد. </li></ol> 4. التضخيم من سلالات بريون طريق PMCA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">يخفف من البذور PMCA إلى الركيزة PMCA في نسبة 01:20 (أي مزيج 5 ميكرولتر من البذور PMCA و 95 ميكرولتر من الركيزة PMCA) في أنبوب PCR. إزالة وتخزين قسامة 15 ميكرولتر في -80 درجة مئوية لمدة unsonicated السيطرة، وسيتم استخدام هذا التحكم لتحديد unsonicated التضخيم برأسية بي ار بي عن طريق الهضم بروتين (PK) K يليه تحليل الغربية (WB) وصمة عار. يمكن إنشاء رقابة إضافية من خلال وضع unsonicated الثانية 15 ميكرولتر قسامة في C ° 37 لمدة رد الفعل PMCA. مطلوب تقل عن ثلاث التكرار لأغراض إحصائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموضوع ما تبقى من العينة (70 ميكرولتر) إلى جولة واحدة من PMCA كما هو مبين في الشكل 1، لوحة A. اهتز كل ساعة أنابيب 5 إلى تجنب تكثيف الماء على الغطاء القبة من الأنبوب PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي نسج أنابيب العينة إلى أسفل وvortexed بلطف (والحرص على أن الحل لا تذهب إلى الحد الأقصى القبة) قبل فتح بعد أي إجراء لضمان homogeneity وتجنب التلوث المحتملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لPMCA مسلسل (sPMCA) من سلالات فترة حضانة قصيرة (أي HY TME، HaCWD، أو 263K)، يخفف من المواد sonicated في نسبة 1:20 من نقل 5 ميكرولتر من العينة sonicated من جولة واحدة في 95 ميكرولتر من المعافين جديدة الدماغ جناسة (الشكل 2، لوحة B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لsPMCA من سلالات فترة حضانة طويلة (أي DY TME، 139H، 22CH، 22AH، أو ME7H)، يخفف من المواد sonicated في نسبة 1:1 من خلال نقل 50 ميكرولتر من العينة sonicated من جولة واحدة في 50 ميكرولتر من المعافين جديدة الدماغ جناسة (الشكل 2، لوحة B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كل منهما من 15 ميكرولتر من خليط مأخوذة من sonicated المخفف سابقا (من الخطوات 4،4 أو 4.5) وتخزين واحد منهم في -80 ° C، والآخر عند 37 درجة مئوية (حلول التحكم unsonicated للجولة PMCA اثنين). إخضاع بقايا لجولة PMCA اثنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تكرار هذا الإجراء إلى أجل غير مسمى. في المختبر لدينا، ونحنكان أداء ما يصل الى جولات PMCA خمسة عشر عاما، مع خصائص سلالة المتبقية دون تغيير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PK هضم العينات. لWB نموذجية، 5 ميكرولتر من مزيج ميكرولتر 80 ميكروغرام / مل إلى 5 من عينة PK (هذا الحل سوف يكون تركيز النهائي من 40 PK ميكروغرام / مل) واحتضان في C ° 37 لمدة ساعة. إضافة 10 ميكرولتر من العازلة تحميل هلام. غلي هذا الحل لمدة 10 دقيقة. السماح للتهدئة والحل تحميل 10 ميكرولتر في هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب نجاح التضخيم إجراء تحليل على عينات WB-PK هضمها لتقدير كمية برأسية بي ار بي تضخيم عن طريق مقارنتها إما، والضوابط unsonicated 20،21 الشكل 2، C أو لوحة لكميات معروفة من عسر الهضم PK-المؤتلف بي ار بي. </li></ol> 5. تجنب انتقال التلوث الخطوات الحاسمة التي يتعين اتخاذها للحد من إنتشار التلوث وحدوث ايجابيات كاذبة بسبب تشكيل نوفو دي من المنتجات المقاومة للالبروتيني. </ف&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مجموعة من الأدوات مخصصة تشريح (ملقط أي ملاقط، مقصات) لجمع العينات لكل سلالة بريون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل المجانسة العقول غير مصاب ليتم استخدامها باعتبارها الركيزة PMCA، امسح ماصات مع التبييض 1٪. نقع في رف أنبوب PCR sonicator، المجانسة الأنسجة، ورفوف التخزين أنبوب PCR مع التبييض 1٪ لمدة 10 دقيقة ويشطف جيدا بالماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية منطقة العمل مع معتاد على الثمالة جديدة مختبر فيرسي الجافة في كل مرة عينة الجديد هو أن المتجانس، تجربة جديدة PMCA هو أن نكون مستعدين، أو عندما aliquoting بين جولات sPMCA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قفازات جديدة في كل مرة يتم التعامل مع عينات جديدة (خصوصا عندما نقل مأخوذة بين جولات sPMCA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام رشقات نارية قصيرة صوتنة لكل دورة PMCA. دورات صوتنة ثوانى 5 جنبا إلى جنب مع الحضانة 10 دقيقة كافية لتضخيم البريونات بدون إنشاء من جديد برأسية 1،20،21،23،24 بي ار بي. كما أظهرت مختبرات أخرى، وزيادةالوقت صوتنة، وزيادة السعة صوتنة، وتقديم عدد من الدورات PMCA يزيد من احتمال لبي ار بي دي نوفو تشكيل برأسية 2. </li></ol>

<ol><li>Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strain-encoded+relationship+between+PrP+replication%2C+stability+and+processing+in+neurons+is+predictive+of+the+incubation+period+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease.</a> PLoS pathogens. 7, e1001317(2011).</li>
<li>Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+infectious+prions+in+vitro+produces+a+new+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype.</a> PLoS Pathog. 5, e1000421(2009).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+physical+properties+of+the+prion+protein+from+two+strains+of+the+transmissible+mink+encephalopathy+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent.</a> J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+PrP+properties+suggest+the+molecular+basis+of+strain+variation+in+transmissible+mink+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy.</a> J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+biologically+distinct+strains+of+transmissible+mink+encephalopathy+in+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters.</a> J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).</li>
<li>Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+species+barrier+by+PrP%28Sc%29+replication+in+vitro+generates+unique+infectious+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions.</a> Cell. 134, 757-768 (2008).</li>
<li>Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+propagation+of+prion+strains%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cell-free propagation of prion strains.</a> EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).</li>
<li>Caughey, B., Raymond, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scrapie-associated+form+of+PrP+is+made+from+a+cell+surface+precursor+that+is+both+protease-+and+phospholipase-sensitive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive.</a> J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).</li>
<li>Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+native+prions+from+minimal+components+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formation of native prions from minimal components in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).</li>
<li>Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+between+different+scrapie+agents+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+New+Biol%22%5BJournal%5D)">Competition between different scrapie agents in mice.</a> Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).</li>
<li>Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+infectious+prions+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Detection of infectious prions in urine.</a> FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).</li>
<li>Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+high+fidelity+prion+amplification+within+and+across+prion+species+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers.</a> PLoS Pathog. 4, e1000139(2008).</li>
<li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+distribution+of+transmissible+mink+encephalopathy+virus+in+mink+inoculated+subcutaneously%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously.</a> J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).</li>
<li>Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+of+protease-resistant+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation of protease-resistant prion protein.</a> Nature. 370, 471-474 (1994).</li>
<li>Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-species+amplification+of+PrP%28CWD%29+and+correlation+with+rigid+loop+170N%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N.</a> Virology. 387, 3235-3240 (2009).</li>
<li>Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sources+of+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Environmental sources of scrapie prions.</a> J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).</li>
<li>Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protease-resistant+cervid+prion+protein+in+water+from+a+CWD-endemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area.</a> Prion. 3, 171-183 (2009).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216, 136-144 (1982).</li>
<li>Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+pathological+prion+protein+by+cyclic+amplification+of+protein+misfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding.</a> Nature. 411, 810-813 (2001).</li>
<li>Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+treatment+of+soil-bound+prions+effectively+inhibits+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).</li>
<li>Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+efficiency+of+soil-bound+prions+varies+with+soil+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Schutt, C. R., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+interference+with+multiple+prion+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Prion interference with multiple prion isolates.</a> Prion. 2, 61-63 (2008).</li>
<li>Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infecting+prion+strains+compete+for+a+limiting+cellular+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource.</a> Journal of. 84, 5706-5714 (2010).</li>
<li>Shikiya, R. A., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+high+titer+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of high titer prions.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genuine+prion+infectivity+by+serial+PMCA%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+microbiology%22%5BJournal%5D)">Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA.</a> Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تحديات تضخيم بروتينات بريون المعدية هي فترات حضانة طويلة ونفقات في التجارب المجراة. هذه التقنية هي وسيلة PMCA فعالة من حيث التكلفة لتضخيم وكلاء بريون المعدية. وقد أكدت عدة مختبرات قدرة PMCA بدقة لتضخيم سلالات بريون في المختبر 7، 9، 12، 14، 19،24. يمكن أن تنتقل الأمراض البريونية بين الأنواع. وقد تلقيح بيسن ومارش فعال الهامستر مع اعتلال الدماغ المنك الانتقال، والتي أنتجت متميزت...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف / معدات </td><td> الصانع </td><td> القط. عدد </td></tr><tr><td> Misonix 3000 </td><td> Misonix </td><td> S-3000 </td></tr><tr><td> Misonix 4000 </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td></tr><tr><td> Tenbroeck الأنسجة المطحنة </td><td> Kontes </td><td> 885000-0007 </td></tr><tr><td> Neslab حمام EX-7 المياه </td><td> الحرارية الكترون </td><td> Neslab EX-7 </td></tr><tr><td> 0،2 أنبوب PCR شرائط مل </td><td> الحرارية العلمية </td><td> AB-0451 </td></tr><tr><td> تريتون X-100 </td><td> سيغما الدريتش </td><td> T9284-100ML </td></tr><tr><td> البروتياز المانع كاملة </td><td> روش </td><td> 11 697 498 001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> JT بيكر </td><td> 4040-00 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> مالينكرودت بيكر Mediatech </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> الحفاضات مختبر فيرسي الجافة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14 206 28 </td></tr><tr><td> Repti ثيرم سخان </td><td> حديقة الحيوان ميد المختبرات، وشركة </td><td> RH-4 </td></tr></tbody></table>

تضخيم بروتين دوري misfolding من البريونات

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

البريونات هي العوامل المعدية التي تسبب الوفاة حتما انتقال مرض جنون (TSE) في الحيوانات والبشر 9،18. من بروتين بريون اثنين من الأشكال الإسوية متميزة، وغير المعدية المضيف ترميز البروتين (بي ار بي C) والبروتين المعدية (بي ار بي SC)، وهو شكل الإسوي بشكل غير طبيعي مطوية من C بي ار بي 8. واحدة من التحديات التي تواجه العمل مع وكلاء بريون هي فترة حضانة طويلة قبل وضع العلامات السريرية بعد التلقيح المضيف 13. هذا تكليف تقليديا طويلة ومكلفة الدراسات الأحيائي الحيواني. وعلاوة على ذلك، تتميز سيئة خصائص البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية للبرأسية بي ار بي بسبب التشكل غير عادية والدول التجميع. بي ار بي برأسية البذور يمكن تحويل C بي ار بي بي ار بي إلى اتفاقية استكهولم في المختبر 14. PMCA هو أسلوب المختبر في أن يأخذ أدفاntage من هذه القدرة باستخدام صوتنة والحضانة دورات لإنتاج كميات كبيرة من بي ار بي برأسية، بمعدل متسارع، من نظام التي تحتوي على كميات الزائدة من بي ار بي C وكميات ضئيلة من البذور برأسية بي ار بي 19. وقد ثبت أن ألخص هذه التقنية بشكل فعال خصوصية الأنواع وسلالة من بي ار بي برأسية التحويل من C بي ار بي، لمحاكاة التدخل سلالة بريون، وتضخيم مستويات منخفضة جدا من بي ار بي برأسية من الأنسجة المصابة، والسوائل، والعينات البيئية 6،7،16، 23. هذه الورقة تفاصيل البروتوكول PMCA، بما في ذلك توصيات للتقليل من التلوث، وتوليد نتائج متسقة، وقياس تلك النتائج. نناقش أيضا العديد من التطبيقات PMCA، بما في ذلك الجيل وتوصيف سلالات بريون المعدية، بريون تدخل السلالة، وكشف عن البريونات في البيئة.

ويستخدم البروتين التضخيم دوري misfolding (PMCA) لتضخيم بي ار بي برأسية في المختبر 7 و 12 و 14 و 19 و 24. ويرد ناجحة التضخيم برأسية بي ار بي زيادة في كثافة الفرقة على البقع الغربية من بروتين بريون PK-مقاومة (المهاجرة ما بين 19 و 30 كيلو دالتون لسلالات الهامستر بريون المشتقة) كما هو موضح في الشكل 3. الزيادة في كثافة الفرقة لها بعد PMCA يشير التضخيم من المواد المقاومة للPK برأسية بي ار بي. ويظهر التضخيم الناجح للبر...

التضخيم البروتين دوري misfolding (PMCA) هو فحص المختبر في لدراسة تحويل بريون والحواجز سلالة والأنواع. ويمكن أيضا أن تستخدم لفحص الكشف عن بريون.

تضخيم بروتين دوري Misfolding من البريونات

البريونات هي عوامل مُعدية تسبب اعتلال الدماغ الإسفنجي المعدي (TSE) الذي يؤدي حتماً إلى الوفاة في الحيوانات والبشر9,18. بروتين البريون...

الهدف من هذا الإجراء هو تضخيم سلالات PreOn المتكيفة مع الهامستر بنجاح في المختبر. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجنيس دماغ هامستر غير مصاب لاستخدامه كركيزة، ثم تحضير النسيج المصاب لاستخدامه كبذرة. وتتمثل الخطوة الثانية في خلط الركيزة والبذرة في أنابيب PCR، ثم إجراء تضخيم دوري لطي البروتين الخاطئ أو PMCA عن طريق دورات من التكسير بالموجات فوق الصوتية والتحضين.بعد ذلك، يتم تخفيف المادة المضخمة بركيزة جديدة وتضخيمها تسلسلياً في المختبر، ثم يتم إجراء تقنية PMCA. وفي النهاية، تُهضم العينات باستخدام proteinase K ثم تُحلل بواسطة لطخة ويسترن (western blot). وفي الختام، يمكن استخدام الزيادة في شدة النطاق في لطخة ويسترن لتحديد التضخيم المختبري لسلالة البريون.يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الـ PreOn، مثل ما هي العوامل المساعدة الهامة المشاركة في تضخيم الـ PreOn؟ وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات في تفاصيل بسيطة ولكنها مهمة تتعلق بالتقنية، بالإضافة إلى ضرورة تجنب التلوث الخلطي للعينات. قبل إجراء عملية التجانس، امسح الماصات بمحلول مبيض بتركيز 1%، وقم بتشبيع حاملات أنابيب الـ PCR المستخدمة في جهاز السونيكيت ومجانسات الأنسجة وحاملات تخزين أنابيب الـ PCR بالمبيض أيضاً.بعد مرور 10 دقائق، اشطف كل قطعة من المعدات جيداً بالماء المقطر، ثم غطِّ منطقة العمل بـ Verly dry lab Soaker جديد. استخدم الآن مطحنة أنسجة 10 buric ومحاليل تخفيف (conversion buffer) مُحضرة حديثاً ومبردة بالثلج لتجنيس دماغ هامستر غير مصاب للحصول على محلول بتركيز 10% وزن/حجم. استخدم محلول ركيزة PMCA، ثم ضع المُجانس في أنابيب مخروطية سعة 15 milliliter وقم بتنقية المحلول المُجانس عن طريق الطرد المركزي عند 500 ×g لمدة 30 ثانية.بعد ذلك، ومع الحرص على تجنب جزء الراسب الكبير، يتم نقل السائل الطافي الناتج إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 milliliter. لتحضير محلول بذرة PMCA، يتم تجنيس المادة المعدية التي تم جمعها لتحضير محلول بتركيز 10% weight per volume كما تم توضيحه للتو، ولكن باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات (DPBS) بدلاً من محلول التحويل، ثم يتم توزيع المحلول في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 0.6 milliliters. قبل البدء في إجراء التضخيم، يتم تغطية منطقة العمل بقطعة امتصاص مخبرية جافة ونظيفة، ثم يتم نقل ركيزة PMCA إلى شريط أنابيب PCR رقيقة الجدران سعة 200 microliter وتخفيف بذرة PMCA فيها بنسبة 1 إلى 20، مع وضع إجمالي أربع مكررات في أنابيب تحمل ملصقات حمراء.ضع مكررين من حصة قدرها 15 µL من كل عينة في أنابيب PCR ذات ملصقات زرقاء لاستخدامها كضابط غير مُشبع عند -80 °C. ضع مكررين إضافيين من حصة قدرها 15 µL من كل عينة في أنابيب PCR ليتم تخزينها عند 37 °C كضابط غير مُشبع إضافي. ثم ضع الضوابط غير المُشبعة عند -80 °C في مجمد بدرجة حرارة -80 °C، وضع الضوابط غير المُشبعة الأخرى في حاضنة بدرجة حرارة 37 °C طوال فترة تفاعل PMCA.ابدأ الآن جولة تضخيم PMCA الأولى بوضع شريط أنابيب PCR الذي يحتوي على الـ 70 µL المتبقية من كل عينة في جهاز سونيكيت (sonicate) متصل بحمام مائي لإعادة التدوير مضبوط على درجة حرارة ثابتة تبلغ 37 °C. يمكن إدراج أنبوب PCR يحتوي على ركيزة PMCA وحدها كعينة ضابطة وهمية (mock control) للتحقق من حدوث تلوث خلطي. املأ ما لا يزيد عن 30% من حامل أنابيب جهاز السونيكيت عن طريق توزيع أنابيب PCR في جميع أنحاء قرن اللوحة الدقيقة (microplate horn). اترك صفاً واحداً على الأقل من المساحة الفارغة بين شرائط أنابيب PCR، ولا تسمح بتوصيل أكثر من أربعة أنابيب معاً في الشريط الواحد.يختلف تضخيم P-R-P-S-C عبر بوق الصفيحة الدقيقة. ويتم الحصول على أفضل كفاءة لتضخيم P-R-P-S-C ضمن نصف قطر قدره خمسة سنتيمترات من مركز بوق الصفيحة الدقيقة. وتتكون جولة واحدة من PMCA من 144 دورة، تتضمن خمس ثوانٍ من الموجات فوق الصوتية و10 دقائق من الحضانة لكل دورة لمدة 24 ساعة تقريبًا لكل جولة من PMCA، وأثناء عملية السونيكة، يتم ضبط السعة ليكون خرج الطاقة يتراوح بين 155 إلى 170 watts.ضع وسادة تسخين خاصة بأحواض السمك على غطاء جهاز السونيكيت لتجنب تكثف الماء، والذي قد يؤدي إلى تلوث العينات بشكل متبادل. قم برج الأنابيب كل خمس ساعات لتجنب تكثف الماء على الأغطية المقببة لأنابيب PCR بعد اكتمال الدورة. أخرج شريط الأنابيب من الجهاز وقم بتدوير العينات لترسيب المحتويات في الأسفل.بعد ذلك، قم برج الأنابيب برفق باستخدام جهاز الـ vortex، مع الحفاظ على المحلول بعيداً عن الغطاء لتجنب التلوث عند فتح الأنابيب، وذلك لتقليل احتمالية التلوث إلى أدنى حد. تجنب لمس الحافة وضع الغطاء على منديل Kim wipe نظيف. بعد ذلك، ولإجراء عملية PMCA تسلسلية لسلالة PreOn، انقل 5 µL من العينة التي خضعت للموجات فوق الصوتية إلى 95 µL من ركيزة PMCA جديدة.استخدم قفازات جديدة لكل عينة. بعد ذلك، اسحب مقدارين من 15 µL من كل عينة من العينات التي خضعت للموجات فوق الصوتية، وخزن أحد المقدارين في درجة حرارة -80 °C والمقدار الآخر في درجة حرارة 37 °C. أما بالنسبة لمحاليل التحكم غير المعالجة للجولة الثانية من تقنية PMCA، فقم بإخضاع المتبقي منها لجولة ثانية من PMCA كما تم توضيحه للتو.يمكن تكرار هذه الخطوة عدة مرات حسب الرغبة. ويمكن تضمين أنبوب PCR يحتوي على ركيزة PMCA من دماغ غير مصاب وحده للتحقق من حدوث تلوث خلطي؛ فبعد تعريض العينات للموجات فوق الصوتية لعدد الجولات المطلوب، اخلط 5 µL من proteinase K بتركيز 18 µg/mL مع 5 µL من العينة التي تعرضت للموجات فوق الصوتية، وعينة الضبط عند -80 °C، وعينة الضبط عند 37 °C في أنابيب PCR منفصلة، ثم قم بهضم العينة عند 37 °C لمدة ساعة واحدة.بعد ذلك، أضف 10 µL من منظم تحميل الجل (gel loading buffer) إلى العينة المهضومة واغلِ المحلول لمدة 10 دقائق. وبعد أن يبرد، قم بتحميل 10 µL من خليط العينة ومنظم تحميل الجل على جل Western block. ولتحديد كمية P-R-P-S-C المضخمة، قارن كمية العينة المهضومة بواسطة proteinase k في تحليل Western blot إما بعينات الضبط غير المعالجة أو بكميات معروفة من proteinase.البروتين المؤتلف غير المهضوم K. يُستخدم P-R-P-C-P-M-C-A لتضخيم P-R-P-S-C في المختبر. يمكن ملاحظة التضخيم الناجح لبروتين PreOn المتكيف مع الهامستر، ومرض CWD في الهامستر، وTME الخامل في تحليل Western BLO هذا من خلال مقارنة شدة الحزم قبل وبعد PMCA. يُظهر هضم P-R-P-S-C بواسطة البروتينيز K متبوعاً بتحليل Western BLO حزمة علوية ووسطى وسفلية تقابل بروتين البريون ثنائي السكر وأحادي السكر وغير السكري على التوالي. يمكن تمييز بعض سلالات PreOn من خلال حركيتها الكهربائية.على سبيل المثال، يوجد فرق بمقدار 2 kilodalton في الهجرة الكهربائية بين سلالات CWD في الهامستر وسلالات TME PreOn في الفئران الخاملة (drowsy). ويُلاحظ هذا التضخيم عالي الدقة من خلال الهجرة الكهربائية المتماثلة لسلالة CWD في الهامستر التي تم تضخيمها بواسطة PMCA مقارنة ببذرة CWD المقابلة لها في الهامستر، وكذلك بالنسبة لسلالة TME في الفئران الخاملة مقارنة ببذرة TME في الفئران الخاملة. وفي حال عدم حدوث تلوث تبادلي أو تشكّل P-R-P-S-C من جديد، يجب أن تظل عينات PMCA الضابطة من OFM صافية بعد الهضم باستخدام proteinase k في تحليل Western blot.أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تنظيف كل قطعة من المعدات قبل استخدام عينة جديدة، وذلك لتجنب التلوث الخلطي.

protein-misfolding-cyclic-amplification-of-prions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

SDD - AGE هو تقنية مفيدة للكشف وتوصيف اميلويد مثل البوليمرات في الخلايا. هنا علينا أن نظهر للتكيف الذي يجعل هذه التقنية قابلة للتطبيقات واسعة النطاق.

الكشف عن تجميع اميلويد بواسطة تغيير طبيعة شبه الكهربائي جل منظفات - Agarose

هنا ، نحن تصف وضع بروتوكول لتنقية نشطة للغاية Hsp104 ، وهو AAA + hexameric البروتين من الخميرة ، والتي المائي ATP الأزواج على تصنيفها البروتين. هذا المخطط يستغل بناء His6 الموسومة لتنقية تقارب...

تنقية Hsp104 ، وهو بروتين Disaggregase

احتضان بإنزيم محلل للبروتين لهضم البريونات الطبيعية ، مع ترك الركام المقاوم سليما.

الكشف عن مجاميع بروتين البريون غير المطوية في أنسجة دماغ الفئران باستخدام النشاف الغربي

يصف هذا الفيديو مقايسة التحلل للبروتينات غير المطوية باستخدام معالجة cycloheximide جنبا إلى جنب مع تجزئة المنظفات. تساعد هذه الطريقة في دراسة ديناميكيات البروتينات غير المطوية والكشف عن الآليات المتعمقة لدوران البروتين.

مقايسة تحلل البروتين المعرض للطي بشكل خاطئ: تقنية لمراقبة تدهور البروتين غير المطوي باستخدام معالجة السيكلوهيكسيميد وتجزئة المنظفات

ظهر مؤخرا  التكاثر الشبيه بالبريون لمجاميع البروتين على أنه متورط في العديد من الأمراض التنكسية العصبية. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف كيفية استخدام الديدان الخيطية C. ايليجانس كنظام نموذجي لمراقبة انتشار البروتين والتحقيق في الظواهر الشبيهة بالبريون.

التحقيق في نشر وسمية البروتينات مثل بريون باستخدام Metazoan نموذج حي<em&gt; C. ايليجانس</em

يصف هذا التقرير بروتوكولات لقياس معدلات تدهور البروتينات غير المطوية إما عن طريق اللطخة الغربية أو المقايسات القائمة على الفلورة. يمكن تطبيق الطرق لتحليل البروتينات الأخرى غير المطوية ولفحص الإنتاجية العالية.

فحوصات لتدهور تتجمع البروتينات في الخلايا

ويصف هذا البروتوكول منهجية الفائق للشاشة وظيفيا للإرث القائم على البروتين في S. cerevisiae.

الفرز الفائق للإرث القائم على البروتين في سيريفيسيا س.

نقدم هنا، بروتوكولا لوصف تقنية تضخيم بريون بسيطة وسريعة وفعالة، طريقة التحويل في الوقت الحقيقي التي يسببها مهتز (RT-كويك).

في الوقت الحقيقي مهتز الناجمة عن تحويل الفحص للكشف عن البريونات CWD في المواد البرازية

تتراكم الأدلة تؤيد فكرة أن المجاميع البروتين المسببة للأمراض المرتبطة بأمراض الأعصاب تنتشر بين الخلايا التي تحتوي على خصائص مثل بريون. هنا، يمكننا وصف أسلوب يتيح للتصور من خلية إلى خلية انتشار بريون مثل المجاميع في نموذج الكائن الحي، melanogaster المورفولوجية.

رصد خلية إلى انتقال بروتين بريون مثل المجاميع في Melanogaster المورفولوجية

الزبالين لديها القدرة على نقل من المعدية التي تنتقل البريونات اعتلال الدماغ الإسفنجي في فضلاتها إلى مناطق خالية من المرض. نحن أساليب التفاصيل المستخدمة لتحديد ما إذا تبقى البريونات سكرابي الماوس تكييفها المعدية بعد مرور الرغم من أن الجهاز الهضمي من الغربان الأمريكية (غراب brachyrhynchos)، مستهلكا شيوعا من الحيوانات النافقة.

إجراءات لتحديد المعدية البريونات بعد المرور عبر الجهاز الهضمي لأنواع الطيور

اكتشف تقنية تضخيم البروتين المطوي بشكل دوري لدراسة تحول البريونات وتحديد سلالاتها في المختبر. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات أمراض البريونات وتطوير طرق الكشف عنها.

تضخيم بروتين دوري Misfolding من البريونات

استكشف المزيد من الفيديوهات