نقل الجينات في أجنة الدجاج أقدم من قبل OVO السابقين Electroporation

وصفت وهناك طريقة لنقل الجينات إلى أجنة الدجاج في مراحل الحضانة في وقت لاحق (أقدم من هامبورغ وهاملتون مرحلة (سمو) 22). هذا الأسلوب يتغلب على عيوب

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء نقل الجينات إلى أجنة الدجاج الأكبر سنا في الجسم الحي لدراسة وظيفة الجينات وتنظيمها في مراحل النمو القديمة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تكسير البويضة أولا في حوالي يوم الحضانة 2.5 ونقل الجنين بأكمله إلى نظام طبق بتري. الخطوة الثانية هي حقن البلازميد ، وترميز الجين المعني في الجزء المناسب من الجنين.

بعد حقن أقطاب البلازميد بجانب الجنين وإجراء التثقيب الكهربائي X ovo ، فإن الخطوة الأخيرة هي جمع الأجنة المثقبة بالكهرباء لتحليلها. في النهاية ، تستخدم الكيمياء المناعية للكشف عن التعبير عن الجينات المنقولة في الجنين. سنوضح لك اليوم كيفية القيام بالتثقيب الكهربائي البيضاوي X باستخدام BULs الدجاج.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن X على التثقيب الكهربائي يمكن أن يتغلب على مشاكل الإفراط في التثقيب الكهربائي المستخدم لنقل الجينات في أجنة الدجاج الأكبر سنا. تتطلب ثقافة X ovo الناجحة لأجنة الدجاج استخدام البيض المخصب الطازج. لا تستخدم البيض المخزن عند 12 درجة مئوية لمدة تزيد عن أسبوع.

ضعي البيض على جوانبه الطويلة في حاضنة سحب قسرية عند 37.5 درجة مئوية مع رطوبة 60٪ بعد الحضانة لمدة 2.5 يوم. عندما تكون الأجنة في حوالي همبرغر وهاميلتون. المرحلة 17 ، أخرج البيض من الحاضنة.

قم بتسمية الجزء العلوي من كل بيضة بقلم رصاص للإشارة إلى اتجاه تكسير كل بيضة. صب حوالي 20 مل من الماء المقطر المعقم في طبق بتري نظيف وكبير بقطر 145 ملم. ضع طبق بتري معقم صغير بقطر 94 ملم في طبق بتري الكبير.

بعد ذلك ، اكسر كل بيضة في الأسفل على حافة معدنية حادة. افتح البيضة بحذر وانقل محتوياتها بالكامل إلى طبق بتري الصغير. لضمان الجودة الجيدة للجنين ، يجب حفظ محتوى البويضة بالكامل في شكل دائري بشكل طبيعي في نظام طبق بتري دون أي إصابة بغشاء فيلين.

بعد نقل محتويات كل بيضة إلى الطبق الصغير ، قم بتغطية الطبق الكبير بغطاء. ضع أنظمة أطباق بتري في حاضنة أخرى لمزيد من الثقافة عند 37.5 درجة مئوية مع حوالي 60٪ رطوبة قبل التثقيب الكهربائي X ovo. استخدم قطبا كهربائيا صغيرا لسحب الشعيرات الدموية الزجاجية من أنابيب زجاجية قطرها 1.0 ملم.

كسر طرف الشعيرات الدموية الزجاجية إلى قطر مناسب. بعد ذلك ، قم بإعداد المعلمات المناسبة للتثقيب الكهربائي مثل الفولتية المختلفة للأنسجة المميزة وحجم الأجنة. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية المناسبة بالكهرباء وفقا للأنسجة المستهدفة وحجم الأجنة.

قم بإعداد محلول بلازميد يحتوي على البلازميدات ، وترميز الجين المستهدف وجين العلامة. في هذا العرض التوضيحي ، يكون الكاديرين سبعة أو CAD سبعة هو الهدف والبروتين الفلوري الأخضر أو GFP هو العلامة. أضف أخضر سريعا إلى التركيز النهائي البالغ 0.1٪ لتسمية محلول البلازميد باللون الأخضر.

أخيرا ، استخدم ماصة الفم لتحميل الشعيرات الدموية الزجاجية بمحلول البلازميد. يتم استخدام أجنة الدجاج من ثقافة X ovo التي تم تحضينها لمدة ستة أيام للتثقيب الكهربائي X ovo. لبدء هذا الإجراء ، استخدم ملقطا دقيقا لتمزيق أغشية التايلين والسلى بعناية فوق التكتوم البصري وإضافة ثلاث قطرات من محلول كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪ على سطح التكتوم.

باستخدام ماصة الفم، قم بحقن محلول البلازميد من الشعيرات الدموية الزجاجية في تجويف التكتوم. ضع الأقطاب الكهربائية بكاثود إبرة التنغستن وأنود لوحة مستطيلة بجانب التكتوم. استخدم الكهربائي على الفور لتطبيق نبضات كهربائية على التكتوم.

قم بتغطية طبق بتري الكبير بالغطاء وأعده إلى الحاضنة بعد يومين أو ثلاثة أيام من التثقيب الكهربائي للبلازميدات التي تشفر GFP و CAD سبعة في تكتوم الدجاج في E ستة ، يتم جمع التكتوم وتثبيته من أجل تلطيخ المناعة. تظهر النتائج في هذا الشكل في E ثمانية. يتم التعبير عن بروتين GFP بقوة في القطر كما هو موضح في صور التثبيت الكاملة هذه هنا.

اللوحة A هي صورة مجال ساطع. اللوحة B هي صورة GFP ، وتظهر اللوحة C. علاوة على ذلك ، في أقسام tectum في E تسعة بروتين GFP مصور باللون الأخضر في اللوحة D و CAD ، يتم التعبير عن سبعة بروتين مصور باللون الأحمر في اللوحة E كما هو ممثل باللون الأصفر في اللوحة F ، وعندما يتم ذلك بشكل صحيح ، تكون كفاءة التثقيب الكهربائي X ovo من 60 إلى 100٪ تشير هذه النتائج إلى أن التثقيب الكهربائي X ovo هو طريقة ناجحة لنقل الجينات إلى أجنة الدجاج الأكبر سنا في الجسم الحي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء نقل الجينات إلى أجنة الدجاج الأكبر سنا ونتمنى لك التوفيق في تجربتك.