بروتوكول لتحديد البروتين البروتين التفاعلات على أساس ¹⁵ N صفها الأيض، مناعي، الكمي والتحوير الطيف الكتلي الانجذاب

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد البروتينات التي تتفاعل تحديداً مع بروتين مستهدف معين في مستخلصات خلوية تحتوي على بروتينات ذائبة وبروتينات غشائية. أولاً، يتم تحقيق وسم أيضي كامل لخلايا chlamydomonas باستخدام النيتروجين 14 والنيتروجين 15، وإنتاج تحللات خلوية تحتوي على TP أو تفتقر إليه. وتساعد خطوة الربط المتقاطع الاختيارية في تثبيت التفاعلات البروتينية-البروتينية العابرة. بعد ذلك، يتم فصل التحللات الخلوية إلى أجزاء مخصبة بالبروتينات غير الذائبة والغشائية، والتي يتم منها استخلاص البروتين المستهدف وشركائه التفاعليين المحددين.

يتم إجراء ترسيب مناعي لبروتين تحكم وبروتينات ملوثة ثم تحليلها. والآن، اخلط البروتينات المترسبة مناعياً وقم بهضمها ثلاثياً وحللها بواسطة LCMS الترادفي. ميزت النتائج بين شركاء التفاعل الحقيقيين والوهميين من خلال إظهار نسب ببتيدية مختلفة لـ 14 nitrogen و 15 nitrogen للبروتينات التي تتفاعل تحديداً مع البروتين المستهدف، ونسب نيتروجين متساوية للبقية.

نسب الببتيد 14 nitrogen 15 للبروتين المستهدف، والبروتين الضابط، والبروتينات الملوثة. وتتمثل الطريقة المختارة لتحليل تفاعلات البروتين-بروتين في ترسيب البروتين المختار مناعيًا بشكل مباشر مع شركاء التفاعل الخاصين به من مستخلصات الخلايا، حيث يوجد كلاهما في هيئتهما وتركيزاتهما الطبيعية.

ومع ذلك، عند القيام بذلك، تترسب أيضاً البروتينات الملوثة بشكل أساسي لأنها تتفاعل مع الأجسام المضادة المستخدمة، ونظراً لأن أجهزة مطياف الكتلة الحديثة حساسة للغاية، فإنها ستحدد بشكل لا لبس فيه البروتينات الملوثة أيضاً، وبالتالي يصبح من المستحيل التمييز بين النتائج الزائفة وشركاء التفاعل الحقيقيين. يتم التغلب على هذه المشكلة من خلال التقنية الموضحة هنا، والتي تعتمد على الترسيب المناعي بتوسيم أيضي بـ 15 N وتعديل الألفة الذي يتم هنا بوساطة حالة A TP ومطياف الكتلة الكمي.

سيقوم ستيفان SCH Malinger، وهو طالب دكتوراه في مرحلة متقدمة في مختبري، بشرح هذه التقنية. بعد وسم الخلايا لمدة 10 أجيال، يتم نقل مقدارين من خلايا chlamydomonas المسمومة بالنيتروجين 14 والنيتروجين 15 إلى أنابيب 4G SA، ثم يتم الحصاد عن طريق الطرد المركزي. تُعلق الرواسب في 2 mL من محلول التحلل المبرد بالثلج، ثم تُنقل المعلقات إلى أنابيب Falcon سعة 15 mL. تُجمع الخلايا المتبقية بإضافة 1 mL إضافي من محلول التحلل لكل مقدار. يُضاف 50 µL من مثبط البروتياز بتركيز 25x و 12.5 µL من كلوريد المغنيسيوم بتركيز 1 M. تُعرض العينات للموجات فوق الصوتية أربع مرات لمدة 20 ثانية على الثلج لضمان التحلل الكامل للخلايا، مع وجود فترات توقف مدتها 20 ثانية بين كل مرة للتبريد.

قم بتحضير أربع وسائد سكروز بحجم 6 mL في أنابيب SW 41 TI ذات جدار رقيق. ضع كامل حجم نواتج تحلل الخلايا بعناية فوق وسائد السكروز. قم بموازنة الأنابيب باستخدام محلول التحلل المنظم، ثم أجْرِ عملية الطرد المركزي لفصل معقدات البروتين الذائبة عن الأغشية.

انقل معقدات البروتين الذائبة من أعلى التدرج إلى أربعة أنابيب فالكون سعة 15 ملليلتر، مع الحرص على تجنب نقل أجزاء من وسادة السكروز. ثم أضف إلى كل عينة Triton X 100 بتركيز 10% ليصل التركيز النهائي إلى 0.5%. اخلط المزيج بعناية وأضف محلول التحلل (lysis buffer) حتى يصل الحجم الإجمالي إلى سبعة ملليلترات.

لتحاليل SDS page وتحاليل الدم المناعية. يتم تخصيص 70 µL من كل مستخلص خلوي ذائب في أنبوب مخروطي جديد سعة 1.5 mL، وإضافة 70 µL من منظم عينات SDS بتركيز 2X. بعد ذلك، يتم التخلص من وسائد السكروز من أنابيب SW 41 TI ذات الجدار الرقيق وإضافة 3 mL من منظم التحلل إلى كل ركيزة.

أضف 1 mL من Triton X 100 بتركيز 10% لتصل إلى تركيز نهائي قدره 2%. بعد إذابة كل راسب بواسطة سونيكاسيون (sonication)، أضف محلول التحلل (lysis buffer) ليصل الحجم الإجمالي إلى 5 mL ثم قم بالطرد المركزي. وكما سبق، اجمع الأجزاء العلوية من معقدات بروتينات الغشاء في أنابيب فالكون سعة 15 mL. أضف محلول التحلل الذي يحتوي على 2% Triton X 100 ليصل الحجم النهائي إلى 7 mL.

استخدم 70 µL من هذه العينات لإجراء تحليل SDS page وتحليلات الدم المناعية. أولاً، قم بموازنة البروتين المقترن بالأجسام المضادة. قم بغسل sero beads مرتين باستخدام 4 mL من منظم التحلل (lysis buffer)، ثم خفف المزيج إلى 8 mL وقم بتقسيمه إلى حصص.

أضف ملليلتر واحد من المعلق إلى كل أنبوب من أنابيب فالكون سعة 15 ملليلتر الثمانية التي تحتوي على معقدات بروتينية ذائبة أو غشائية من خلايا موسومة بالنيتروجين 14 والنيتروجين 15، وكانت غنية بـ TP أو مستنزفة منه، ثم حضنها لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 °C على جهاز تدوير الأنابيب لترسيب المعقدات البروتينية. قم بترسيب الخرز عن طريق الطرد المركزي، وتخلص من السوائل الطافية مع ترك حجم صغير من السائل فوق الخرز لمنع التلوث من البروتينات الملتصقة بالجدران البلاستيكية. انقل العينات إلى أنابيب مخروطية جديدة سعة 1.5 ملليلتر لجمع كل الخرز المتبقي في أنابيب فالكون. أضف 0.8 ملليلتر أخرى من محلول التحلل الذي يحتوي على 0.1% Triton إلى كل أنبوب، ثم قم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس، واجرِ طردًا مركزيًا لطيفًا لنقل المحلول مع الخرز المتبقي إلى أنابيب إينور. بعد عدة خطوات من الغسيل، قم بطرد العينات مركزيًا لمدة 15 ثانية عند 16,100 ×g ودرجة حرارة 4 °C.

أزل رواشح العينات أولاً باستخدام ماصة عادية. ثم أزل أي رواشح متبقية تماماً باستخدام حقنة هاميلتون سعة 50 µL. أضف 100 µL من محلول الاستخلاص المُحضّر حديثاً إلى كل عينة، ثم قم بالتحضين في جهاز خلط حراري (thermo mixer) بسرعة 800 RPM، ثم قم بطرد العينات مركزياً لمدة 15 ثانية عند 16,100 ×g ودرجة حرارة 25 °C.

انقل الآن كل سائل طافٍ إلى أنبوب جديد باستخدام حقنة هاميلتون سعة 50 µL نظيفة. أضف أيضاً 50 µL من محلول الاستخلاص إلى حبيبات المعالجة كما فعلت مع العينات سابقاً، ثم اجمع النواتج المستخلصة المقابلة. تذكر الاحتفاظ بـ 30 µL من جميع نواتج الاستخلاص (EITs) الخاصة بالعينات لإجراء تحليل SDS page وتحليلات الدم المناعية.

الآن، قم بدمج الرواسب المستخلصة من البروتينات الذائبة والبروتينات الغشائية الموسومة بالنيتروجين 14 والنيتروجين 15 المعالجة بـ TP موجب وسالب. ثم قم بإجراء عملية الاختزال والألكلة والهضم الأولي باليوريا العالية كما هو موضح في المخطوطة المرفقة. انتقل بعد ذلك إلى عملية هضم تريبتيكية (triptych digest) على عجلة دوارة لمدة 16 ساعة على الأقل.

عند درجة حرارة 37 °C. يتم تجميع حبيبات التريبسين في شكل كتلة (Pellet) عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 16,100 ×g ودرجة حرارة 4 °C. تُنقل السوائل الطافية إلى أنابيب إبندورف (Eppendorf) جديدة سعة 2 mL.

اغسل الأنابيب القديمة بـ 50 µL من بيكربونات الأمونيوم بتركيز 20 mM، وحمض الأسيتيك بتركيز 0.5%، ثم اجمع السوائل مع الرواسب الطافية الأولى. لتحضير رؤوس C 18 المنزلية لإزالة الأملاح من العينات، قص قرصين من مادة emcor C 18 باستخدام إبرة حقنة وأدخلهما في رأس ماصة سعة 200 µL. بعد ذلك، اثقب أغطية أربعة أنابيب einor سعة 2 mL وأدخل الرؤوس فيها، ثم قم بتهيئة رؤوس C 18 باستخدام 50 µL من المحلول B، ثم قم بالطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند 800 G ودرجة حرارة 25 °C.

بعد ذلك، يتم موازنة رؤوس أنابيب C 18 باستخدام 100 µL من المحلول، ثم يتم استخدام جهاز الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند 800 G و 25 °C. كرر خطوة الموازنة هذه مرة أخرى. انتقل بعد ذلك لتحميل 100 µL من رواسب العينات الناتجة عن عمليات الهضم الثلاثية على رؤوس أنابيب C 18، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند 800 G و 25 °C.

كرر تحميل العمود حتى يتم تطبيق كامل السوائل الطافية للعينات. بعد غسل رؤوس نصائح C 18، استخلص الببتيدات التربتيكية في أنبوب إينور نظيف سعة 1.5 milliliter باستخدام 50 µL من المحلول B، ثم قم بالطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند 800 G ودرجة حرارة 25 °C. كرر خطوة الاستخلاص مرة واحدة، ثم جفف الببتيدات تماماً في جهاز SpeedVac.

قم بتعليق الببتيدات المجففة في 20 µL من المحلول A واحضنها لمدة ساعة واحدة على الأقل في الثلج، مع التخلل بفترتين من الحضن مدة كل منهما 15 دقيقة في جهاز طرد مركزي ذي حمام سونيك لمدة 20 دقيقة عند 16,100 ×g ودرجة حرارة 4 °C، ثم قم بتطبيق Senna على nano C-M-S-M-S HSP 70. من المعروف أن بروتينات الصدمة الحرارية تتفاعل مع مرافقات مرافقة وركائز محددة فقط في غياب ATP؛ وفي مستخلصات الخلايا هذه الملحومة بالنيتروجين 14، يتمركز hs P 70 B وCGE one بشكل حصري تقريباً في الجزء القابل للذوبان بغض النظر عن حالة ATP. وفي المقابل، يتمركز CF 1 beta في كل من الأجزاء القابلة للذوبان والأجزاء الغنية بالغشاء.

بما أن عملية السونيكاتيون (sonication) تؤدي إلى قص جزء من CF one beta من الغشاء الموجود في A TP Synthes، فإنها تعمل كضابط تحميل (loading control) لكلتا الكسرين. وقد ترسبت كميات مماثلة من H HSP 70 B باستخدام الأجسام المضادة anti HSP 70 B من المستخلصات الذائبة الموّسمة بالنيتروجين 14 والنيتروجين 15 بغض النظر عن حالة A TP. وفي المقابل، ترسبت مستويات منخفضة من بروتين HS P 70 B من الكسور الغشائية، مع وجود كميات أكبر قليلاً ناتجة عن الكسور الغشائية المستنفدة من a TP مقارنة بالكسور الممتلئة بـ a TP، وهو ما يتوافق مع الألفة المتوقعة لـ CGE E one تجاه hs.

يعتمد P 70 B على السياق. لم يتم ترسيب CGE one بشكل مشترك مع HS P 70 B في الأجزاء الذائبة أو الغشائية الغنية بـ TP. وتترابط كميات بروتين CGE one المترسبة بشكل مشترك مع HS P 70 B من الأجزاء الذائبة المستنفدة من TP والأجزاء الغشائية المستنفدة من TP كمياً مع كمية HSP 70 B المترسبة. كما لوحظ تفاعل CGE one مع HS P 70 B فقط في حالة A DP عند التحليل باستخدام مطياف الكتلة.

في هذه التجربة، تم تحضير رواسب لمزيج من المستخلصات الموّسمة بالنيتروجين 14 التي تفتقر إلى TP ومستخلصات موّسمة بالنيتروجين 15 تحتوي على A TP. بينما تم اكتشاف الأشكال الموّسمة بالوزن الثقيل والخفيف لببتيد HS P 70 B بكثافات متساوية، تم اكتشاف الشكل الموّسم بالوزن الخفيف فقط لببتيد CGE one من المستخلصات المستنفدة من A TP. وتظهر هنا الببتيدات نفسها من راسب anti HS P 70 D DB المشتق من مزيج من مستخلصات خلوية ذائبة موّسمة بشكل تبادلي. وبناءً على ذلك، تم اكتشاف الشكل الموّسم بالوزن الثقيل فقط لببتيد CGE one في المستخلصات المستنفدة من a TP، بالإضافة إلى كلا ببتيدي HSP 70 B الموّسمين بالوزن الخفيف والثقيل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك تصور جيد حول كيفية إجراء تجربة ترسيب مضاد للجسم (co-precipitation) مع تحضير العينة لتحليل مطيافية الكتلة. تذكر أن التلوث بالبروتينات البشرية، وخاصة الكيراتين، سيؤثر سلبًا على قياساتك في مطياف الكتلة، ولذلك فإن احتياطات السلامة مثل ارتداء القفازات، والعمل في بيئة نظيفة، واستخدام كواشف بدرجة LCMS تعد أمرًا بالغ الأهمية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.