بروتوكول لتحديد البروتين البروتين التفاعلات على أساس ¹⁵ N صفها الأيض، مناعي، الكمي والتحوير الطيف الكتلي الانجذاب

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد البروتينات التي تتفاعل على وجه التحديد مع بروتين مستهدف معين في مستخلصات الخلايا التي تحتوي على بروتينات قابلة للذوبان وغشائية. أولا ، قم بتحقيق وضع العلامات الأيضية الكاملة لخلايا الكلاميدوموناس بالنيتروجين 14 والنيتروجين 15 وتوليد محللات الخلايا التي تحتوي على TP وتفتقر إليها. تساعد خطوة الربط المتقاطع الاختيارية على استقرار تفاعلات بروتين البروتين العابرة. بعد ذلك ، افصل الخلية المحللة إلى أجزاء ، وبروتينات غير قابلة للذوبان وغشاء غنية منها البروتين المستهدف ، شركائه المحددين في التفاعل.

يتم ترسيب بروتين التحكم والبروتينات الملوثة والإشارة إليه. الآن ، قم بخلط البروتينات المترسبة المناعية وهضمها ثلاث مرات وتحليلها بواسطة LCMS الترادفي. ميزت النتائج بين شركاء التفاعل الحقيقي والخاطئ من خلال إظهار نسب مختلفة من النيتروجين و 14 نيتروجين و 15 للبروتينات التي تتفاعل على وجه التحديد مع البروتين المستهدف والنيتروجين المتساوي.

14 نيتروجين 15 نسب ببتيد للبروتين المستهدف وبروتين التحكم والبروتينات الملوثة. الطريقة المفضلة لتحليل تفاعلات بروتين البروتين هي ترسيب البروتين المفضل مباشرة من خلال تفاعله. شركاء من مستخلصات الخلايا حيث يحدث كلاهما في تأكيدهما الأصلي وتركيزاتهما.

ومع ذلك ، عند القيام بذلك ، يتم ترسيب البروتينات الملوثة أيضا لأنها تتفاعل مع الأجسام المضادة المستخدمة كمطياف الكتلة الحديثة حساسة للغاية. سوف يحددون أيضا بشكل لا لبس فيه البروتينات الملوثة ، وبالتالي من المستحيل التمييز بين الخطأ وشركاء التفاعل الحقيقيين. يتم التغلب على هذه المشكلة من خلال التقنية الموضحة هنا ، والتي تستند إلى 15 N وضع العلامات الأيضية لتعديل تقارب الترسيب المناعي هنا بوساطة حالة A TP وقياس الطيف الكتلي الكمي.

سيتم عرض هذه التقنية من قبل ستيفان SCH Malinger ، وهو طالب دكتوراه كبير في مختبري. بعد وضع العلامات على الخلايا لمدة 10 أجيال ، قم بنقل حصتين من كل من خلايا النيتروجين 14 والنيتروجين 15 المسمى بخلايا الكلاميدوموناس إلى أنابيب 4G SA التي يتم حصادها عن طريق الطرد المركزي Resus ، وتعليق الكريات في ملليلترين من محلول تحلل الجليد البارد ولنقل المعلقات إلى 15 مليلتر من أنابيب Falcon ، تجمع الخلايا المتبقية مع مليلتر إضافي واحد من محلول التحلل لكل Eloqua. أضف 50 ميكرولترا من مثبط البروتياز 25 × و 12.5 ميكرولتر من عينات سونيكات كلوريد المغنيسيوم المولي أربع مرات 20 ثانية على الجليد لخلية كاملة ISIS مع 22 فواصل بينهما للتبريد.

قم بإعداد أربع وسائد سكروز سعة ستة ملليلتر في أنابيب الجدار الرقيقة SW 41 TI. ضع بعناية الحجم الكامل للخلية المحللة على وسائد السكروز. التوازن مع التحلل والمخزن المؤقت وأجهزة الطرد المركزي لفصل مجمعات البروتين القابلة للذوبان عن الأغشية.

انقل مجمعات البروتين القابلة للذوبان من أعلى التدرج إلى أربعة أنابيب صقر سعة 15 مل. تأكد من تجنب نقل أجزاء من وسادة السكروز. ثم أضف إلى كل عينة 10٪ تريتون × 100 إلى التركيز النهائي 0.5٪ ، امزج بعناية وأضف مخزن التحلل إلى الحجم الإجمالي البالغ سبعة ملليلتر.

لصفحة SDS وتحليلات الدم المناعي. ضع جانبا 70 ميكرولترا من كل مستخلص خلية قابلة للذوبان في أنبوب مخروطي جديد سعة 1.5 مليلتر وأضف 70 ميكرولترا من عينتين من عينتين من XSDS. بعد ذلك ، تخلص من وسائد السكروز من أنابيب الجدار الرقيقة SW 41 TI وأضف ثلاثة ملليلتر من محلول التحلل إلى كل حبيبات.

أضف مليلتر واحد من 10٪ tritton X 100 إلى التركيز النهائي 2٪ بعد إذابة كل بيليه عن طريق الصوتنة ، أضف عازلة التحلل إلى الحجم الإجمالي البالغ خمسة ملليلتر وأجهزة الطرد المركزي. كما كان من قبل ، قم بحصاد الأجزاء العلوية من مجمعات البروتين الغشائي في أنابيب صقر سعة 15 ملليلترا. أضف المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على 2٪ tritton × 100 إلى حجم نهائي يبلغ سبعة ملليلتر.

استخدم 70 ميكرولترا من هذه العينات لصفحة SDS وتحليلات الدم المناعي. أولا موازنة البروتين المقترن بالجسم المضاد. حبات مصلية مع غسلتين أربعة ملليلتر من عازلة التحلل مخففة إلى ثمانية ملليلتر وكمية عالية.

مليلتر واحد من المعلق لكل من أنابيب الصقر الثمانية سعة 15 ملليلتر التي تحتوي على مجمعات بروتين قابلة للذوبان أو غشاء من TP مليء بالنيتروجين المستنفد 14 والنيتروجين 15 تحتضن لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية على أسطوانة أنبوبية لترسيب مجمعات البروتين التي تحطس الخرزات عن طريق الطرد المركزي ، تخلص من المواد الطافية ، واترك كمية صغيرة من السائل فوق الخرز لمنع التلوث من البروتينات الملتصقة بالجدران البلاستيكية. انقل العينات إلى أنابيب مخروطية جديدة سعة 1.5 ملليلتر لجمع جميع الخرزات المتبقية في أنابيب الصقر. أضف 0.8 مل أخرى من محلول التحلل الذي يحتوي على 0.1٪ تريتون إلى كل دوامة ، وجهاز طرد مركزي برفق ، ولنقل المخزن المؤقت بالخرز المتبقي إلى أنابيب einor بعد عدة خطوات غسيل ، عينات أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية عند 16 ، 100 مرة جم وأربع درجات مئوية.

قم بإزالة العينة من المواد الطافية أولا باستخدام ماصة عادية. ثم قم بإزالة أي مادة طافية متبقية تماما باستخدام حقنة هاميلتون سعة 50 ميكرولتر. إلى كل عينة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الشطف المحضر حديثا واحتضان العينات في خلاط حراري بسرعة 800 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية عند 16 و 100 مرة جم و 25 درجة مئوية.

الآن انقل كل مادة طافية إلى أنبوب جديد باستخدام حقنة هاميلتون نظيفة سعة 50 ميكرولتر. أضف أيضا 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف إلى عملية الخرز كما هو الحال مع العينات من قبل وقم بتجميع الإيلات المعنية. تذكر أن تحتفظ ب 30 ميكرولترا من جميع عينات EITs لصفحة SDS وتحليلات الدم المناعي.

الآن اجمع بين الرواسب المراوغة من زائد وناقص النيتروجين المعالج TP 14 والنيتروجين 15 المسمى البروتينات القابلة للذوبان والغشاء. ثم قم بإجراء الألكلة المخفضة وهضم اليوريا العالي الأولي كما هو موضح في المخطوطة المصاحبة. انتقل إلى ملخص ثلاثي الأجزاء على عجلة دوران لمدة 16 ساعة على الأقل.

عند 37 درجة مئوية. حبيبات حبات التريبسين مع الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 16 و 100 مرة جم وأربع درجات مئوية. انقل المواد الطافية إلى أنابيب einor جديدة سعة ملليلتر.

اغسل الأنابيب القديمة ب 50 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 20 مللي مولار ، وحمض الخليك 0.5٪ وتجمع مع المواد الطافية الأولى. من أجل تحضير نصائح C 18 محلية الصنع لتحلية العينات ، قم بقطع قرصين من مادة emcor C 18 بإبرة حقنة وإدخالهما في طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر. ثم قم بعمل ثقوب في أغطية أربعة أنابيب إينور سعة ملليلتر وأدخل الأطراف مسبقا لأطراف المرحلة C 18 مع 50 ميكرولترا من جهاز الطرد المركزي للمحلول B لمدة ثلاث دقائق عند 800 جم و 25 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بموازنة أطراف المرحلة C 18 مع 100 ميكرولتر من المحلول ، وجهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق عند 800 جم و 25 درجة مئوية. كرر خطوة التوازن هذه مرة أخرى. استمر في تحميل 100 ميكرولتر من عينة المواد الطافية من عمليات الهضم ثلاثية الأجزاء على جهاز الطرد المركزي لأطراف المرحلة C 18 لمدة ثلاث دقائق عند 800 جم و 25 درجة مئوية.

كرر تحميل العمود للتطبيق الكامل للعينة الطافية بعد غسل أطراف المرحلة C 18 ، قم بمسح الببتيدات التربتية في أنبوب إينور جديد سعة 1.5 مليلتر مع 50 ميكرولتر من جهاز الطرد المركزي للمحلول B لمدة ثلاث دقائق عند 800 جم و 25 درجة مئوية. كرر الخطوة المثالية مرة واحدة ثم جفف الببتيدات حتى الانتهاء في سرعة VAC reus.

الببتيدات المجففة في 20 ميكرولترا من المحلول A واحتضانها لمدة ساعة واحدة على الأقل على الجليد ، متقاطعة بحضانتين لمدة 15 دقيقة في جهاز طرد مركزي للحمام الصوتي لمدة 20 دقيقة عند 16 و 100 مرة جم وأربع درجات مئوية وتطبيق Senna على nano C-M-S-M-S HSP 70. من المعروف أن بروتينات الصدمة الحرارية تتفاعل مع مرافقين وركائز معينة فقط في حالة عدم وجود TP في هذه المستخلصات الخلوية المسماة بالنيتروجين 14 hs P و 70 B و CGE one مترجمة بشكل حصري تقريبا إلى الجزء القابل للذوبان المستقل عن حالة A TP. في المقابل ، يتم توطين CF one beta لكل من الكسور القابلة للذوبان والمخصبة بالغشاء.

منذ الصوتنة مقص جزء من CF واحد بيتا من الغشاء الموجود في A TP Synthes, فإنه بمثابة التحكم في التحميل لكلا الكسرين. تم ترسيب كميات مماثلة من H HSP 70 B مع الأجسام المضادة ل HSP 70 B من النيتروجين 14 والنيتروجين 15 المسمى مستخلصات قابلة للذوبان مستقلة عن حالة A TP. في المقابل ، فإن المستويات المنخفضة من بروتين HS P 70 B تترسب من كسور الغشاء بكميات أكبر قليلا تنشأ من كسور غشائية مستنفدة TP مقارنة بكسور TP المليئة بالتقارب المتوقع ل CGE E واحد ل hs.

P 70 B يعتمد على السياق. لم يتم ترسيب أي CGE مع HS P 70 B.In كسور قابلة للذوبان أو غشائية مليئة ب TP. ترتبط كميات بروتين CGE واحد المترسبة مع HS P 70 B من كسور TP المستنفدة والقابلة للذوبان وكسور الغشاء المستنفدة TP مرتبطة كميا بكمية HSP 70 B المترسبة ، كما لوحظ تفاعل CGE واحد مع HS P 70 B فقط في حالة A DP في التحليل عن طريق قياس الطيف الكتلي.

في هذه التجربة ، تم تحضير الرواسب لمخاليط من النيتروجين 14 مستخلصات تحمل علامة تفتقر إلى TP والنيتروجين ، و 15 مقتطفات مصنفة تحتوي على TP. بينما تم الكشف عن الأشكال الثقيلة والخفيفة من الببتيد HS P 70 B بكثافة متساوية ، تم الكشف فقط عن الشكل المسمى بالضوء من CGE ، وهو ببتيد واحد من المستخلصات المستنفدة A TP. يتم عرض نفس الببتيدات من الراسب المضاد ل HS P 70 D DB المشتق من مخاليط من مستخلصات الخلايا القابلة للذوبان ذات العلامات المتبادلة هنا. وفقا لذلك ، تم الكشف فقط عن الشكل الثقيل للببتيد المكون من CGE في مستخلصات TP المستنفدة بالإضافة إلى كل من ببتيدات HSP 70 B الخفيفة والثقيلة ذات العلامات الخفيفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك انطباع جيد عن كيفية إجراء تجربة هطول الأمطار مع تحضير العينة لتحليل قياس الطيف الكتلي. لا تنس أن التلوث بالبروتين البشري ، وخاصة الكيراتين ، سيزعج قياسات الوقاية في مقياس الطيف الكتلي ، وبالتالي فإن احتياطات السلامة مثل القفازات والبيئة النظيفة ومناطق درجة LCMS ضرورية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.