خلق بيئات الغازية محددة لدراسة تأثير نقص الأكسجة في C. ايليجانس

الهدف من التجربة التالية هو إنشاء غرفة نقص الأكسجة والحفاظ عليها باستخدام طريقة التدفق المستمر. يتم تحقيق ذلك من خلال الحصول على الأنابيب والقوارير والغرف اللازمة للإجراء وتصنيعها. كخطوة ثانية ، قم بتوصيل خزان الأكسجين وحدد معدل التدفق لإنشاء المستوى المطلوب من نقص الأكسجة.

قم بترطيب الغاز عن طريق تمريره عبر قارورة فقاعية مملوءة بالماء منزوع الأيونات. قم بتوصيل الغاز المائي بغرفة نقص الأكسجة وضع عينات الاختبار في الغرفة لتعريضها لظروف نقص الأكسجة. تم الحصول على النتائج التي تظهر الفتك الجنيني المعتمد على Hi F1 في نقص الأكسجة بناء على ملاحظة الجدوى حتى مرحلة البلوغ.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل صناديق القفازات ، هي أنها سهلة وغير مكلفة لتصنيعها في المختبر وتوفر تركيزا دقيقا وقابلا للتكرار للغازات في الغرفة البيئية. في حين أن هذه الطريقة توفر نظرة ثاقبة لاستجابة نقص الأكسجين في أناقة الديدان الخيطية C ، إلا أنه يمكن أيضا تكييفها مع أنظمة أخرى ، بما في ذلك الكائنات الحية النموذجية الأكبر حجما وزراعة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه لدراسة الغازات الأخرى ، بما في ذلك ثاني أكسيد الكربون وكبريتيد الهيدروجين.

يوضح هذا البروتوكول كيفية بناء غرفة نقص الأكسجة. يتم تخزين الغاز في خزانات الغاز المضغوط بتركيزات أكسجين محددة ، ويتم توصيل منظم على مرحلتين. يدخل الغاز إلى الجزء السفلي من أنبوب التدفق ، ويخرج من الأعلى بمعدل التدفق الصحيح.

ثم يتدفق الغاز إلى قارورة الفقاعة لترطيب الغاز. ثم ينتقل الغاز المائي إلى غرفة نقص الأكسجة عند صمام التدفق ، مما يعرض العينات لنقص الأكسجة. ينفث الغاز أخيرا إلى الغرفة من خلال فتحة عادم محفورة في الغرفة.

يمكن استخدام طبق تبلور Pyrex أو في صندوق عبوة الأسهم كجسم للغرفة البيئية. يجب أن يكون حجم الحاوية عند الحد الأدنى ويجب أن تكون المادة غير منفذة للغاز. قم بحفر ثقب في جانب واحد من الحاوية بطرف كربوني أو ماسي ، وحفرها وتناسب مع تركيب شوكة خرطوم بلاستيكي.

امزج الايبوكسي قبل وضعه على الصندوق والتركيب. ثم كرر نفس الإجراء على الجانب الآخر من الحاوية مع إزاحة الثقب الثاني من الأول. لزيادة الخلط المضطرب ، استخدم قطرا خارجيا بحجم ثماني بوصة أو أنبوب FEP أو نايلون لتوصيل خزانات الغاز المضغوط بجهاز التحكم في التدفق ، مثل وحدة التحكم في التدفق الشامل أو مقياس الدوار.

يجب أن يكون لخزانات الغاز تركيزات أكسجين محددة متوازنة مع النيتروجين وهو معيار معتمد لمحتوى الأكسجين أو لظروف نقص الأكسجين. يستخدم النيتروجين النقي منظما على مرحلتين مع ضبط المرحلة الثانية على الضغط المطلوب. راجع الإرشادات الموجودة في البروتوكول المكتوب لتحديد معدل التدفق المناسب.

ثم قم بتوصيل الأنبوب من منظم المرحلتين بأنبوب التدفق الذي يتحكم في معدل تدفق الغاز الذي يدخل الغرفة. يتم توصيل منافذ أنبوب التدفق بزجاجة غسيل غاز بأسطوانة ممزقة تحتوي على ماء مقطر. ثم قم بتوصيل الأنبوب الموجود على الجانب الآخر من زجاجة الغسيل بأحد التركيبات الموجودة في الغرفة البيئية.

سيؤدي ذلك إلى ترطيب الغاز الذي يدخل الغرفة البيئية. استخدم الشحوم المفرغة لإغلاق الغرفة. ثم ضع الأوزان على غطاء الغرفة لضمان إحكام الإغلاق.

اختبر الختم عن طريق حمل كمية صغيرة من الماء في راحة يد مرتدية قفاز على عادم الغاز الموجود في الغرفة والتحقق من وجود فقاعات. أولا ، قم بإنشاء مجموعات متزامنة من البحر Elgan. ضع من واحد إلى 100 غرام من البالغين في قطرة من محلول التبييض القلوي على سطح صفيحة وسائط نمو الديدان الخيطية غير البذرة.

اترك محلول التبييض يمتص في اللوحة بعد فترة حضانة لا تقل عن ثماني ساعات. انقل اليرقات المتزامنة L إلى صفيحة مصنفة ببكتيريا OP 50 الحية. بدلا من ذلك ، اسمح للبالغين GRA بوضع البيض على الطبق لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات لتوليد مجموعة من الديدان التي ستتطور بشكل متزامن أو اختيار L أربعة يرقات من مجموعة مختلطة لجمع الأجنة الصغيرة.

في مرحلة الخلايا التي تتراوح بين خليتين وأربع خلايا، استخدم شفرة حلاقة لتقطيع البالغين البالغين من الخلايا الوراثية في كمية صغيرة من الماء ثم نقل الأجنة عن طريق الماصة الفموية قبل نقل الديدان إلى الصفيحة للتعرض لظروف نقص الأكسجين. ضع حلقة من 10 ملليغرام لكل مليلتر من حمض البالمتيك في الإيثانول حول حافة الألواح. لمنع الديدان من الهروب من سطح صفيحة الأجار.

سوف يخرج حمض البالمتيك من المحلول. نظرا لأن الإيثانول يتبخر مكونا حاجزا ماديا لضمان التوحيد ، تأكد من استبدال الماء الموجود في زجاجة غسيل الغاز قبل التعرض له في الغرفة البيئية. بعد نقل الديدان إلى الألواح ، أغلق الألواح في الغرفة البيئية ، وابدأ تدفق الغاز ، وحافظ على التعرض للوقت المطلوب للفحص.

من أجل بقاء الأجنة حتى مرحلة البلوغ ، اسمح للديدان بالتطور بعد 48 ساعة من العودة إلى هواء الغرفة ، وعند هذه النقطة يجب أن تكون كذلك. يسجل يرقات المرحلة الرابعة أو البالغين في يوم واحد من أجل البقاء حتى مرحلة البلوغ. لتصور الديدان التي تتعرض لنقص الأكسجين ، انقل الديدان إلى قطرة M تسعة على زلة غطاء مربعة مقاس 22 ملم واقلبها على وسادة 2٪ من الضوضاء في M تسعة إذا لزم الأمر.

يمكن استخدام 25 ملليمولار من الأمول أو 10 ملليمولار أزيد الصوديوم كمخدر. بدلا من ذلك ، بعد التعرض لنقص الأكسجة ، يمكن وضع الغرفة البيئية الشفافة مباشرة على مرحلة نطاق التشريح. يتم عرض طريقتين ، واحدة ، بما في ذلك إعداد تدفق الغاز بالكامل.

الآخر مع الغرفة فقط على مرحلة المجهر. قم بزراعة ديدان بريستول N على أربع صفائح نمو بارتفاع 10 سم حتى تصبح غالبية الديدان بالغة من GR. اغسل الديدان في أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 ملليلتر بمحلول مبيض قلوي من واحد إلى خمسة واحتضنه بالتناوب حتى تبدأ الديدان في الذوبان.

لا تزيد عن خمس دقائق. اغسل الديدان ثلاث مرات مع M تسعة تدور لأسفل عند 1 ، 500 مرة G بين كل غسلة بدون لوحة كسر. يتم تبييض الأجنة على 8 150 ملم من ألواح NGM وتسمح للأجنة بالتطور إلى L أربعة يرقات لمدة 48 ساعة تقريبا.

عند 22 درجة مئوية ، انقل الصفائح إلى الغرفة البيئية وتعريضها لظروف نقص الأكسجين ونقص الأكسجين لمدة أربع ساعات أو للمدة المحددة في التصميم التجريبي. لحصاد العينات بسرعة ، قم بإزالة الغطاء إلى غرفة نقص الأكسجين. خذ لوحة عينة واحدة وأعد إغلاق وقت الغرفة وسجل الخطوات.

بعد إزالة الديدان من نقص الأكسجة ، يجب أن تستغرق هذه العملية برمتها أقل من دقيقتين. استخدم الماء المقطر لغسل الديدان على مرشح نايلون ثم اسكبه في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على 100 ميكرولتر من أجهزة الطرد المركزي SDS بنسبة 1٪. الديدان في SDS في جهاز طرد مركزي لسطح المكتب هي 1 ، 500 ضعف G لمدة 15 إلى 20 ثانية.

مع الكسر ، استخدم فراغا لإزالة معظم السوبينات من الأنبوب ، وترك حبيبات الدودة كما هي. باستخدام ماصة ، انقل حبيبات الدودة بحجم محدد مسبقا من السائل إلى أنبوب نفايات صغير 1.5 مسمى. إذا كان سيتم استخدام العينة لصفحة SDS ، فيمكن أن يحتوي هذا الأنبوب على حجم متساو من مرتين لتحميل البروتين لإغلاق الأنبوب وغمره في النيتروجين السائل.

كرر حتى يتم عزل جميع العينات. اتبع هذه الإجراءات لعينات التحكم في هواء المنزل لعينات الاتساق يمكن تخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. يوضح هذا الرقم صلاحية الأجنة المعرضة ل 1000 جزء في المليون من الأكسجين ، و 5000 جزء في المليون من الأكسجين ، ونورموكسيا حوالي 210000 جزء في المليون من الأكسجين.

تتعرض الأجنة لكل حالة لمدة 24 ساعة في غرف الأكسجين ذات التدفق المستمر. تم نقل الديدان إلى ظروف طبيعية سمح لها بالتطور إلى مرحلة البلوغ لمدة 48 ساعة ، ثم سجلت لقابليتها للبقاء حتى مرحلة البلوغ. باتباع هذا الإجراء ، يمكن جمع العينات لتحليلها لاحقا بواسطة Western blot QPCR أو المقايسات الفسيولوجية مثل العمر الافتراضي أو إنتاج النسل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية إعداد غرفة نقص الأكسجة ذات التدفق المستمر في مختبرك الخاص.