في تحليل المختبر من PDZ التي تعتمد على المجمعات ضخم الجزيئات CFTR اشارة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تجميع معقد إشارات جزيئي ضخم لـ CFTR (منظم التوصيل عبر الغشائي للتليف الكيسي) المعتمد على PDZ في المختبر. ولتحقيق ذلك، يتم التعبير عن البروتينات الاندماجية المدمجة المعاد تركيبها في البكتيريا ثم تنقيتها. بعد ذلك، يتم الحصول على نواتج تحلل الخلايا من مستنبتات تعبر عن CFTR أو البروتينات المرتبطة بـ CFTR.

بعد ذلك، يتم دمج CFTR والبروتينات الرابطة في المختبر لتجميع المعقد الإشاري جزيئي الضخامة الذي يحتوي على CFTR. ثم يُجرى تحليل لطخة ويسترن، والذي يثبت تكوين معقدات CFTR جزيئية الضخامة، ويتم تقييم ذلك عبر لطخة ويسترن. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في قدرتنا على الكشف المباشر وتصوير تكوين معقد جزيئي ضخامة فردي يحتوي على بروتينات عالية من CFTR.

وبالتالي، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة حول تكوين المعقد الجزيئي الكبير الذي يحتوي على CFTR. كما يمكن تطبيقها في تجميع المعقدات غير البروتينية التي لا تشارك فيها CFTR، مثل معقد الإشارات الجزيئي الكبير sex C two. ومؤخراً، وباستخدام هذه الطريقة نفسها، أثبتنا أن المستقبل الكيميائي CXCR two يشكل فعلياً معقداً بروتينياً مع المؤثرات النهائية.

توسط PRC beta three الـ wild nerve one في الخلايا المتعادلة باستخدام PCR. يتم تضخيم DNA الذي يشفر آخر 50 إلى 100 حمض أميني التي تحتوي على motifs PDZ عند الطرف C. وذلك بالنسبة لناقل CAMP، وMRP four، ونطاق PDZ 1 الخاص بعامل تنظيم مبادل الصوديوم والهيدروجين أو N-H-E-R-F.

بعد ذلك، يتم استنساخ نواتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لـ RP4 في ناقل PGE X 4 T1 لإنتاج بروتينات اندماج GST، واستنساخ نطاق PDZ1 لبروتين N-H-E-R-F في ناقل PET 30. ولإنتاج بروتينات اندماج His، يتم تحويل البكتيريا عن طريق الصدمة الحرارية. ثم تُنمى المزارع البكتيرية طوال الليل عند درجة حرارة 37 °C في حاضنة هزازة، باستخدام 50 milliliters من وسط LB الذي يحتوي على المضادات الحيوية المناسبة للناقل، وذلك في سلالة من بكتيريا e coli تفتقر إلى البروتياز، وفي وسط SOC.

في اليوم التالي، يتم تخفيف المزرعة بنسبة 1:10 في 500 milliliters من وسط Luria berti، ثم تُحضن المزرعة مرة أخرى مع الرج عند 37 degrees Celsius. وبعد ساعتين، يتم تحفيز نسخ البروتين المؤتلف باستخدام 0.5 to 1 millimolar من IPTG لمدة أربع ساعات عند 30 degrees Celsius.

بعد الحضانة، انقل المزارع إلى أنابيب طرد مركزي سعة 250 milliliter وقم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 8, 000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من الطافي وأضف 20 milliliters من محلول السكروز المنظم الذي يحتوي على lysozyme بتركيز 1 mg/mL و 0.2% Triton X 100 ومثبطات البروتياز لتحليل الخلايا، ثم انقل المعلق البكتيري إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 milliliter.

اخلط المزيج باستخدام هزاز دوار لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 20,000 ×g لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. بعد عملية الطرد المركزي، سيكون الطافي رائقاً وستظهر حبيبات app غير ذائبة في قاع الأنبوب.

اجمع السائل الطافي الرائق في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 milliliter. ثم أضف إلى السائل الطافي 1 milliliter من الراتنج المناسب. Aero beads المعلقة على شكل ملاط بنسبة 50% في sucrose buffer glutathione.

يجب استخدام خرزات Aero لبروتينات GST الاندماجية، وخرزات talon لبروتينات hiss S الاندماجية. اخلط المزيج لمدة أربع ساعات عند درجة حرارة 4 °C باستخدام هزاز دوار. بعد ذلك، قم بدوران الخرزات عند 800 ×g لمدة دقيقتين.

ثم اغسلها عن طريق إعادة التعليق، حيث يتم تعليقها في 15 milliliters من PBS وخلطها على جهاز تدوير لمدة دقيقتين. وأخيراً، تخلص من السائل الطافي. كرر هذه الخطوة ست مرات بعد الغسلة السادسة.

لشطف البروتين من الخرزات، أضف 2 mL من محلول الشطف المناسب لكل 1 mL من الخرزات، ثم اخلط المزيج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. صب كامل كمية البروتين المشطوف مع الخرزات في عمود فصل، ثم اجمع السائل النافذ باعتباره البروتين المشطوف. بعد ذلك، انقل البروتين الذي تم إزالة ملوحته (UD) إلى أنبوب الديلزة.

قم بإجراء الديلزة للبروتينات المستخلصة مقابل لترين من PBS مع التقليب عند درجة حرارة 4 °C. استبدل PBS كل أربع ساعات لأربع مرات عقب عملية الديلزة. ركز البروتين حتى يصل حجمه إلى 0.5 إلى 1 milliliters.

باستخدام مرشح طرد مركزي بحد قطع قدره 10,000 megawatt. يتم تقسيم العينة إلى حصص حجم كل منها 200 µL. تُحفظ حصة واحدة للتحليل وتُوضع الحصص الأخرى في درجة حرارة -80 °C للتخزين.

حدد تركيز البروتين باستخدام طريقة برادفورد (Bradford Method). وقيم جودة البروتين بواسطة الفصل الكهربائي للهلام بوجود دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS page) باستخدام معايير BSAS. وفي حال كانت سلامة البروتين غير مرضية، يمكن استخدام إجراءات تنقية ثانوية مثل الترشيح الهلامي أو التبادل الأيوني.

يجب زراعة خلايا HEK 2 93 التي تعبر عن النوع البري من flag CFTR كما هو موضح في المستند المرفق. قم بإزالة الوسط من الخلايا واغسلها باستخدام PBS. بعد ذلك، ومن أجل تحلل الخلايا، أضف 500 µL من محلول التحلل (lysis buffer) لكل طبق زراعة بقطر 60 mm وقم برج نواتج تحلل الخلايا لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

انقل المواد المتحللة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة. ثم للتخلص من البروتينات غير الذائبة، قم بإجراء الطرد المركزي عند 16,000 ×g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C واجمع السوائل الطافية. حدد تركيز البروتين باستخدام مقايسة Bradford لتجميع المعقدات الجزيئية الكبيرة التي تحتوي على CFTR في المختبر.

ابدأ بدمج 20 µg من بروتين G-S-T-M-R-P four الاندماجي المنقى المكون من 50 حمضاً أمينياً في الطرف الكربوكسيلي، مع كميات متزايدة تتراوح من 0 إلى 40 µg من بروتين hiss S PD zk one الاندماجي المنقى في 200 µL من محلول التحلل (lysis buffer) داخل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL. اخلط البروتينين باستخدام خلاط دوار عند درجة حرارة 22 °C لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين. بعد ذلك، أضف 20 µL من معلق بنسبة 50% من حبيبات الغلوتاتيون إلى خليط البروتين واستمر في الخلط لمدة ساعة أخرى.

يُشار إلى هذه الخطوة أيضاً باسم الارتباط الزوجي، حيث يرتبط G-S-T-M-R-P four CT 50 بـ SPD zk one. خلال هذا الوقت، قم بتحضير محللات خلايا HEK 2 93 التي تعبر بشكل مفرط عن wild type flag CFTR كما هو موضح في القسم السابق من الفيديو بعد خطوة الارتباط الزوجي. اغسل المعقد مرتين باستخدام lysis buffer span عند 800 ×g لمدة دقيقة واحدة لكل غسلة، وقم بشفط الطافي بعناية بعد كل غسلة.

توخَّ الحذر لتجنب سحب الخرز من القاع. أضف نواتج تحلل خلايا HT K 2 93 إلى الخرز وامزجها بلطف باستخدام خلاط دوار عند درجة حرارة 4 °C لمدة ثلاث ساعات أو طوال الليل بعد الحضن. اغسل الخرز ثلاث مرات باستخدام منظم التحلل مع إجراء عملية طرد مركزي بعد كل غسلة كما سبق، وبعد الغسلة الأخيرة.

لاستخلاص البروتينات، أضف 30 µL من منظم العينات بتركيز 5x واحضن الخليط في حمام مائي عند 37 °C لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بالطرد المركزي بسرعة 5,000 ×g لمدة دقيقة واحدة لترسيب الحبيبات. ثم، قم بتحميل كافة المستخلص على هلام SDS-PAGE بتركيز 4 إلى 15%، وقم بتشغيله عند 200 فولت حتى نهاية الهلام. بعد انتهاء التشغيل، انقل حزم البروتينات إلى غشاء PVDF لمدة 1.5 ساعة عند 60 فولت باستخدام جهاز نقل من شركة BioRad.

بعد اكتمال عملية النقل، قم بحجب الغشاء في محلول TBS tween يحتوي على 5%non-fat milk لمدة ساعة واحدة. تابع إجراء تحليل لطخة ويسترن (western blotting) كما هو موضح في المستند المرفق لتصوير البروتينات المتفاعلة مع CFTR. لقد تم تجميع معقد إشارات جزيئي كبير يحتوي على CFTR في المختبر (in vitro) كما هو موضح في هذا الفيديو وكما يظهر في هذا التمثيل التصويري.

تكون معقد جزيئي ضخم بين الأحماض الأمينية الخمسين الطرفية C لبروتين Mr.RRP four و PD zk one وبروتين CFTR كامل الطول لتحديد مدى اعتماد تكوين المعقد الجزيئي الضخم على الجرعة. تم إدراج كميات متزايدة من البروتين الوسيط PD ZK one كما هو موضح هنا. وقد زاد المعقد بشكل يعتمد على الجرعة، مما يشير إلى أن البروتين الوسيط PD ZK one توسط في التفاعل بين CCF TR و Mr.Rrp four.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم غلي عينات معقدات الجزيئات الدقيقة في حاوية FTR المُحضرة لتقنية western blotting، حيث أن تجمع FTR يمثل مشكلة شائعة. وبدلاً من ذلك، ينبغي تسخين العينات عند 37 degree لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة قبل تحميلها في الهلام باتباع هذا الإجراء. كما يمكن إجراء طرق أخرى مثل coun precipitation من أجل تقييم معقدات CFTR الداخلية في خلايا مثل الخلايا الظهارية للمجاري التنفسية والخلايا الظهارية للأمعاء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع معقد إشارات جزيئي ضخم من نوع CFDR المعتمد على PTC في المختبر.