C. ايليجانس تتبع وقياس السلوكية

تحديد النمط الظاهري. يُعد تتبع حركة *C. elegans* أداة مهمة في اكتشاف الجينات والعصبونات المشاركة في سلوك *C. elegans*. تظهر *C. elegans* سلوكيات حركية نمطية مثل الحركات الأمامية والخلفية وأنواع مختلفة من الدوران عن طريق تغيير شكل أجسامها. ولتقدير هذه الحركات كمياً عبر مسافات طويلة وبدقة مكانية وزمانية عالية، قمنا ببناء جهاز تتبع للديدان لالتقاط حركة *C. elegans* أثناء زحفها على سطح طبق أغار.

لقد قمنا أيضاً بتطوير برمجيات لعزل هذه الحركات وتحليلها كمياً باستخدام برامج مخصصة كُتبت بلغتي LabVIEW وMATLAB. ويتمثل التحدي في جميع أنظمة تتبع الفيديو في إنتاج كميات هائلة من البيانات ذات أبعاد عالية جداً. وقد تعامل برنامج معالجة الصور وتحليل البيانات الخاص بنا مع هذا التحدي عن طريق تقليل أشكال الديدان إلى مجموعة من المكونات المستقلة، وبذلك تمكنا من إعادة بناء سلوك الديدان بشكل شامل كدالة لثلاثة إلى أربعة أبعاد فقط.

يتم إضاءة طبق أغار بواسطة مصدر ضوء ليفي وتصويره باستخدام كاميرا. هذا النظام مثبت على منصة نقل XY. يتم تحريك المنصة بواسطة محركات خطوية قياسية، متصلة بوحدة تحكم في المحرك الخطوي.

يتم توصيل وحدة التحكم والكاميرا بجهاز الكمبيوتر، ويتم التحكم فيهما بواسطة برامج مخصصة مكتوبة بلغة LabVIEW. تقوم الكاميرا بتصوير سطح طبق آغار وتحديد الأجسام الداكنة على خلفية فاتحة. يتم وضع علامة معايرة لعملية المعايرة التلقائية عن طريق وخز سطح الآغار.

باستخدام أداة التقاط الديدان، يتم ضبط جودة الصورة بحيث يتمكن البرنامج الحاسوبي من قياس الأشياء كمياً في الوقت الفعلي. ويمكن ضبط مستوى الكسب والسطوع وسرعة الغالق للكاميرا لتوفير جسم داكن على خلفية بيضاء. كما يمكن مراجعة الصورة الثنائية المفلترة التي يستخدمها برنامج التتبع.

يحتوي البرنامج على ميزة معايرة تلقائية تقوم بحساب مصفوفة المعايرة عن طريق تحريك جسم اختبار لمسافة ثابتة. وتقوم مصفوفة المعايرة بمعايرة المسافات المقاسة بالبكسل وفقاً للخطوات التي يقوم بها المحرك الخطوي.

بعد المعايرة، يصبح النظام جاهزاً للعمل ولا يحتاج إلى إعادة معايرة إلا في حال تغيير قوة التكبير أو إعادة ضبط وضعية الكاميرا. ستُستخدم حلقة نحاسية لمحاصرة الديدان ومنعها من الهجرة إلى حافة الطبق. قم بتسخين الحلقة أولاً عن طريق وضعها على كتلة تسخين أو ما يعادلها.

يجب تسخين الحلقة لمدة دقيقة واحدة تقريبًا. ضع الحلقة على طبق آغار جديد واضغط لأسفل قليلاً لغمرها في سطح الآغار. وسيتم استخدام طبق آغار مملوء بمحلول NGM buffer لغسل الديدان في المرحلة L4 ومرحلة البلوغ المبكرة من بقايا الطعام.

بعد التقاط الديدان ووضعها في محلول NGM المنظم، اتركها تسبح لبضع دقائق. ضع واحدة من الديدان المغسولة بعناية على لوح التتبع بالقرب من مركز الحلقة. سيتم استخدام هذا اللوح لاحقاً في جهاز تتبع الديدان.

ضع الطبق الذي تم تحضيره على منصة تتبع الديدان. قم بتشغيل برنامج LabVIEW واختيار الخيارات إذا لزم الأمر، مثل موقع حفظ الصور، وأنواع الصور، والقياسات، وإعدادات الكاميرا. باستخدام عصا التحكم، حرك المجهر حتى تظهر صورة الدودة في مجال الرؤية على شاشة الكمبيوتر.

ثم اضغط على track لتفعيل برنامج التتبع. نوضح هنا دودة يتم تتبعها في الوقت الفعلي. يقوم البرنامج الحاسوبي بقياس حركات الصور المفلترة ثنائياً كما هو موضح، ويمكنه إجراء قياسات لهذه الصورة في الوقت الفعلي.

بعد التتبع، يمكن إجراء إعادة بناء للمسار العالمي من خلال حركات المحرك الخطوي، بينما يمكن رؤية التغيرات الموضعية في شكل الدودة بالتفصيل. تزحف الديدان عن طريق القيام بحركات تموجية. ونقوم بالتقاط هذه الحركات عن طريق تحويل الدودة إلى هيكل يتكون من منحنى مركزي واحد، ومن ثم وصف هذا المنحنى كمجموعة من الزوايا.

ثم نقوم بتفكيك الهياكل إلى أشكالها الأساسية، والمعروفة أيضاً باسم المتجهات الذاتية (eigen vectors). وباستخدام هذه الأنماط الذاتية، يمكننا إعادة بناء أشكال الدودة وقياس حركاتها كمياً. ومن خلال استخدام أول نمطين، يمكننا تحديد الموضع الطوري للدورة التموجية للدودة بدقة، كما هو موضح في اللوحة الثانية.

تُظهر اللوحة الأولى التوزيع المشترك للنمطين الأول والثاني، مما يسلط الضوء على دورة حدية دائرية. وتتوافق حركة الطور في اتجاه واحد مع الحركة إلى الأمام، بينما تتوافق حركة الطور في الاتجاه الآخر مع الحركة إلى الخلف. وبالتالي، تتوافق سرعة الطور مع سرعة الدودة.

في الفضاء الحقيقي، يمكن ملاحظة الارتباط القوي بين الطور والسرعة في العالم الحقيقي في اللوحة الأخيرة. وباستخدام سرعة الطور المشتقة من نمط Eigen، يمكننا الكشف عن بعض التفاصيل الدقيقة في سلوك أناقة البحر التي قد تغفل عنها العين. فعلى سبيل المثال، يشير التوزيع المشترك لسرعة الطور والطور بوضوح إلى أن الديدان تغادر حالة التقدم وتدخل إليها بشكل تفضيلي عند أطوار محددة من الحركة.

لقد استعرضنا هنا نظام تتبع سهل الاستخدام يقوم بتسجيل صور تفصيلية لسلوك ديدان السيليكون أثناء زحفها على الأسطح وأطباق ACA. إن كمية المعلومات الواردة في هذه الصور ضخمة ومتعددة الأبعاد، ولذلك ابتكرنا أيضاً طريقة لتقليل أبعاد البيانات إلى أربعة مقاييس أساسية. وتتميز هذه المقاييس بسهولة تفسيرها فيما يتعلق بسلوك الديدان.

تم إعداد هذا العمل لقياس سلوك الديدان عند تعديلات منخفضة، كما يمكن استخدام النظام أيضاً لقياس النشاط العصبي باستخدام المناطق المطلية والمعدلة جينياً. يتميز النظام ككل بمرونة في التصميم، ويمكن استخدامه مع أنظمة زحف أخرى مثل Doof law وLOEs.