النمذجة التهاب القولون المتعاونة مع السرطان مع Azoxymethane (AOM) ودكستران كبريتات الصوديوم (DSS)

في اليوم صفر، يتم حقن الفئران بـ azoxymethane أو OM في الأسبوع التالي. ويتم استبدال مياه الشرب الخاصة بها بمحلول يحتوي على dextran sulfate sodium أو DSS. وفي الأسبوع الثالث، تُعطى الفئران مياه شرب عادية لمدة الأسبوعين التاليين.

يتم تكرار دورة DSS المائية هذه مرتين إضافيتين. وبعد دورة DSS الثانية، يمكن تقييم الفئران للكشف عن الأورام عن طريق التنظير الداخلي المرآتي.

بعد الأسبوع العاشر، يتم التضحية بالفئران وجمع القولون. يتم غسل القولون وفتحه طولياً، ثم يتم تقييم القولون لتحديد حجم الأورام وعددها.

يمكن تضمين مقطع طولي من القولون مقسم إلى أثلاث وإرساله للتحليل النسيجي. وباستخدام المجهر الضوئي، يمكن عدّ الأورام وتصنيفها. نحن نستعرض بروتوكولاً يتم فيه إعطاء العامل المسبب للتسمم الجيني OM، يليه ثلاث دورات من العامل المسبب للالتهاب.

يؤدي DSS إلى توليد أورام في القولون لدى الفئران بشكل سريع ومتسق، مع وجود تشابهات مورفولوجية وجزيئية مع تلك التي تُلاحظ في سرطان القولون المرتبط بالتهاب القولون لدى البشر. يتم تمييز كل فأر بشكل فردي باستخدام علامات على الذيل أو قصاصات من الأذن في اليوم صفر، ويُسجل الوزن الأساسي لكل فأر في جدول، ثم يُحقن كل فأر بمحلول بتركيز 10 mg/kg من OM exercise. يجب توخي الحذر عند التعامل مع OM لكونه عاملاً ساماً للجينات. في اليوم السابع، يتم تزويد الفئران بمحلول DSS بتركيز 2.5% كمياه شرب للأسبوع التالي. لتحضير هذا المحلول، يُضاف مسحوق DSS إلى الماء المقطر ويُخلط حتى الذوبان.

يصبح المحلول جاهزاً بعد تمريره عبر مرشح أسيتات السليلوز بمسامية 0.2 micron. ولضمان توفير إمداد مستمر من محلول DSS لمدة سبعة أيام، يتم استبدال DSS كل يومين إلى ثلاثة أيام.

بعد هذه الفترة، يتم إعادة الأقفاص إلى الماء لمدة أسبوعين. تزن الفئران مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع، مع مراقبة حدوث نزيف شرجي أو إسهال. قد تصاب الفئران التي تعاني من أورام كبيرة بتدلي شرجي مؤقت، إلا أن هذا لا يقلل عادةً من نسبة البقاء على قيد الحياة.

يُستخدم فقدان الوزن بالنسبة للقيمة المرجعية كمقياس بديل لشدة التهاب القولون. ويمكن توقع فقدان في الوزن يصل إلى 10% مصحوباً بالإسهال ونزيف شرجي لمدة تتراوح بين يومين إلى ثلاثة أيام في الأسبوع الذي يلي دورة كاملة من DSS endoscopy. Following. يمكن إجراء الدورة الثانية أو الثالثة من DSS لتأكيد نمو الورم في الجسم الحي قبل التضحية بالحيوان.

نظرًا لأن نموذج A-O-M-D-S-S موثوق للغاية في إحداث الأورام، فإن هذه الخطوة ليست ضرورية بشكل عام. يجب تقييم عدد قليل فقط من الفئران باستخدام هذه الطريقة لأنها قد تؤدي إلى تعطيل أورام الفئران. يجب أن تشتمل منطقة العمل الخاصة بك على دورق من المحلول الملحي الملحق بالفوسفات والعازل أو PBS، بالإضافة إلى دورق فارغ.

للتخلص من محلول PBS المستخدم، اسحب من 8 إلى 10 ملليلتر من محلول PBS في سرنجة وقم بتوصيلها بنهاية المنظار لكل استخدام. وعند غسل المحتويات داخل اللمعة، يتم تخدير كل فأر عن طريق التسكين المستنشق أو القابل للحقن وتثبيت الفأر على لوح مسطح باستخدام شريط لاصق عند الذيل والصدر، ويمكن قرص وسائد قدم الفأر. ولضمان التسكين الكافي، استخدم إبهامك وسبابتك لقرص أسفل بطن الفأر لكشف الشرج، ثم أدخل منظار muren في مستقيم الفأر.

استخدم محلول PBS برفق للنفخ والري لتحسين الرؤية داخل التجويف وإزالة المحتويات البرازية. استمر في دفع المنظار ببطء مع مراقبة الشاشة. وبالنسبة لوجود أورام عيانية في اليوم 70، يجب أن يكون كل فأر معالج بـ A-O-M-D-S-S مصاباً بأورام متعددة في القولون وجاهزاً للتقييم.

يمكن تأخير هذه المرحلة لأسابيع أو أشهر إذا كانت هناك رغبة في الحصول على أورام أكبر حجماً. قم بتجهيز حقنة مملوءة بـ PBS متصلة بإبرة تغذية أنفية (gavage needle). حقنة محملة بـ 10% formalin، ومقصات جراحية أساسية، ومقصات ذات رؤوس مستديرة.

سرنجة صغيرة محملة بمحلول Ian Blue بتركيز 1% وملقط دقيق. كما يتم تجهيز صينية تبريد، وقارب نقل يحتوي على PBSA مبرد، وشفرة حلاقة جديدة للتقطيع، وحوض تثبيت مملوء بـ 10% formalin. يتم التنافيض (القتل الرحيم) لكل فأر باستخدام isof fluorine والخلع العنقي أو أي طريقة أخرى معتمدة مؤسسياً. ويمكن إجراء قياس الوزن النهائي والقياسات الأخرى.

في هذه المرحلة، ضع الفأر على لوح تقطيع بحيث يكون الجانب البطني للأعلى. رُش البطن بـ 70% ethanol للحفاظ على خلو منطقة التشريح من الشعر. استخدم الملقط للإمساك بخط منتصف البطن واصنع شقاً صغيراً في الجلد للكشف عن البريتون.

استخدم شدًا لطيفًا لفصل الجلد عن البريتون وكشف تجويف البطن بالكامل. قم بعمل شق في البريتون ومد هذا الشق على طول الحافة الضلعية من الجانبين. استخدم مقصًا مغلقًا لإزاحة الأمعاء الدقيقة والقولون إلى الجانب.

سيؤدي ذلك إلى كشف العقد اللمفاوية المساريقية، والتي يمكن استئصالها اختيارياً. ولإجراء التقييم، يتم إزاحة المسالك البولية التناسلية نحو الأسفل لكشف القولون النازل والمستقيم، مع استئصال المثانة والأعضاء التناسلية حسب الضرورة لمزيد من كشف الحوض، مع توخي الحذر لتجنب إتلاف الأنسجة المجاورة.

قم بالقص عبر الرامي العاني السفلي والعلوي للكشف عن الوصل الشرجي المستقيم. قص الجلد حول الوصل الشرجي المستقيم لتحرير القولون مع تطبيق شد لطيف نحو الأعلى. باستخدام ملقط مساريقي، يمكن استئصال ارتباطات القولون أو فصلها بدقة.

من المهم الاحتفاظ بجزء من الجلد عند الموصل الشرجي المستقيم لأن هذه المنطقة غالباً ما تصاب بالخلل التنسجي. قم بفصل الأمعاء الغليظة عن الأمعاء الدقيقة في المنطقة التي تسبق الأعور مباشرة. افصل الأعور عن القولون المجاور باستخدام إبرة تغذية مفرغة مقاس 18 gauge متصلة بمحقنة سعة خمسة مللتر.

اغسل القولون بمحلول PBS بارد جداً بحيث يتدفق السائل في الاتجاه الفسيولوجي باستخدام مقص ذو حواف مستديرة. افتح القولون على طول مساريقه. ثم افرد القولون المفتوح فوق الصينية الباردة.

تأكد من ذوبان الصينية بشكل كافٍ حتى لا تتجمد الأنسجة. ضع بضع قطرات من صبغة 1%Ian Blue باستخدام الإصبع لتحسين رؤية الأورام. قم بتقييم عدد الأورام وحجمها باستخدام مسطرة أو التقط صوراً لإجراء تحليل رقمي.

يمكن استئصال مقاطع صغيرة من الورم والأنسجة الطبيعية المجاورة في هذه المرحلة لإجراء تحليلات مستقبلية باستخدام طرق RNA أو البروتين أو الكيمياء النسيجية المناعية، مع ترك جزء من القولون للتقييم النسيجي. يتم وضع فورمالين 10% في القولون المتبقي على الصينية المبردة بواسطة حقنة أو الإصبع، مع ترك الأنسجة للتثبيت لمدة 30 ثانية على الأقل. وبهذه الطريقة، يتم تسهيل عملية النقل إلى حوض التثبيت.

تأكد من مسح بقايا الفورمالين قبل رسم قولون مفتوح جديد على الصينية نفسها. انقل القولون إلى حوض مليء بـ 10% formalin وثبته من الحواف باستخدام الدبابيس. بعد ثلاث ساعات من التثبيت، تخلص من formalin واستبدله بـ 70% ethanol.

يمكن حفظ القولون في إيثانول بتركيز 70% لفترة غير محدودة. استخدم حرارة منخفضة لتحضير محلول Agar بتركيز 2%، وجهز شريحة نظيفة على لوح زجاجي. قم بتقطيع القولون المثبت إلى ثلاثة أجزاء، وأعد القطع غير المستخدمة إلى حوض الإيثانول.

قُم بتقليم المقاطع لتكون ذات حجم موحد باستخدام شفرتي حلاقة. ثبّت مقاطع وطبقات القولون في الآجار على شريحة نظيفة. كرر هذه العملية للمقطع التالي من القولون.

قم بقص الشريحة، وإزالة الآجار الزائد، ووضع القولون المضمن في كاسيت للمعالجة والصبغ بالهيماتين والإيوسين. يوضح الشكل واحد البروتوكول المتبع لتحفيز سرطان القولون المرتبط بالتهاب القولون. بينما يوضح الشكل اثنين وزن الفئران بالنسبة إلى الوزن المرجعي أثناء إعطاء OM وDSS.

لاحظ أنه في الأسبوع الذي يلي كل دورة من دورات DSS، تفقد الفئران من 5 إلى 10% من وزن جسمها. ويُعد فقدان الوزن في هذه التجربة مؤشراً بديلاً لشدة التهاب القولون. يوضح الشكل ثلاثة منظراً للأورام في القولون البعيد عبر تنظير القولون للفئران في اليوم 50 من العلاج بـ A-O-M-D-S-S.

لاحظ الكتل polypoid المتعددة التي تسد تجويف القولون البعيد في اللوحتين B وC مقارنة بالقولون الطبيعي. تظهر اللوحة (أ) من الشكل 4 قولون فأر مفتوح طوليًا يوضح المظهر العياني للأورام. لاحظ زيادة العبء الورمي في القولون البعيد والقوام المخطط المميز للقولون الداني مع نمو ورمي ضئيل.

يوضح الشكل خمسة الأورام التي تم إبرازها عن طريق تطبيق صبغة lc والصبغة الزرقاء. لاحظ كيف تبرز الصبغة النسيج الطبيعي للقولون بالإضافة إلى حدود كل ورم على حدة. يمكن أن تكون هذه الصبغ مفيدة في القياس الدقيق لمساحات الأورام باستخدام المسطرة أو القياس الرقمي.

يوضح الشكل ست التوزيع التمثيلي لمتوسط عدد الأورام لكل فأر عولج بـ OM و DSS. لاحظ أن غالبية الأورام تقع في القولون القاصي ويقل حجمها عن 2 mm. يوضح الشكل سبع مقاطع طولية من القولون مثبتة في البارافين داخل كاسيت وشريحة مصبوغة بـ H and E.

لاحظ أن بقايا صبغة S والصبغة الزرقاء لا تتداخل مع صبغ h و e. تم وضع دائرة حول ورم كبير في صورة الشريحة. وتنتج التسميات "القاصي" و"الأوسط" و"الداني" من تقسيم القولون بالكامل إلى ثلاثة أجزاء بين الأعور والشرج.

يوضح الشكل 8 النسيج التمثيلي لورم ناتج عن حقن OM وإعطاء DSS في القولون النازل. تظهر الصور المجهرية مصبوغة بـ H و E-B-R-D-U و beta-catenin، وتكشف عن تغيرات خلل تنسجية مماثلة لسرطانات القولون الغدية البشرية. في هذا الفيديو، قدمنا بروتوكولاً لتحفيز تكون أورام القولون المدفوعة بالالتهاب في الفئران، وذلك باستخدام حقنة واحدة من OM تليها ثلاث دورات من DSS مدة كل منها سبعة أيام.

على مدى فترة زمنية تبلغ 10 أسابيع، يحفز هذا النموذج ظهور أورام ذات تغيرات نسيجية وجزيئية تشبه إلى حد كبير تلك التي تحدث في سرطان القولون المرتبط بالالتهاب لدى البشر، وهو ما يوفر نموذجاً ذا قيمة عالية لدراسة التسرطن والوقاية الكيميائية في هذا المرض.