أخذ العينات الإنسان Peptidome اللعاب الأصلية باستخدام مسبار الترشيح الفائق المصاصة، مثل: تبسيط وتعزيز الكشف الببتيد لقياس الطيف الكتلي السريرية

تستخدم هذه الدراسة لـببتيدات اللعاب مسبار ترشيح فائق يشبه المصاصة (lollipop) يليه تحليل مباشر باستخدام قياس الطيف الكتلي بكروماتوغرافيا السوائل النانوية (nano LC LT Q). أولاً، قم بتجميع مسبار LLUF باستخدام غشاء من بولي إيثر سلفون وأنبوب من إيثيلين بروبيلين. بعد ذلك، اجمع عينات اللعاب من المتطوعين وقم بمعالجتها عبر مسبار LLUF لأخذ عينة من اللعاب.

بعد ذلك، انتقل مباشرة إلى تحليل مطيافية الكتلة nano L-C-L-T-Q وقم بتحليل البيانات المستمدة من عينات اللعاب المعالجة بمسبار LLUF وغير المعالجة به. وفي النهاية، يمكن الحصول على ببتيدات اللعاب من خلال تحليل بيانات L-C-M-S-S ومقارنة الببتيدات المحددة بين العينتين. وتوفر هذه الطريقة، التي تستخدم مسبار ترشيح فائق يشبه المصاصة مقترناً بتحليل مباشر بمطيافية الكتلة nano lc LTQ، مزايا رئيسية مقارنة بالطرق الأخرى مثل هضم بروتينات اللعاب إلى ببتيدات.

وعقب تحليل مطيافية الكتلة، يعمل جهاز LUF PRO على تبسيط وتنقية اللعاب، كما يعزز من قدرة مطيافية الكتلة على رصد الببتيدات في اللعاب الكامل للتطبيقات السريرية. باستخدام غراء الإيبوكسي، قم بتثبيت أغشية البولي إيثر الخاصة بالهاتف الخلوي على حواف مجاديف البولي بروبيلين المثلثة. بعد ذلك، قم بتوصيل أنبوب تيفلون من بروبيلين الإيثيلين المفلور بمخرج أسطواني للمثلث.

قم بتعقيم مجسات مجداف البولي بروبيلين بتركيز 70% alcohol طوال الليل، ولتقييم إحكام الغلق بشكل صحيح، اغمر مجسات LLUF في محلول Blue dextran بتركيز 50 mg/mL لمدة ساعتين. تأكد من خلو العينات التي تم جمعها من Blue dextran.

استقطب متطوعين أصحاء تتراوح أعمارهم بين 20 و40 عاماً. بعد المضمضة بالفم باستخدام الماء، اطلب من الشخص بصق عينات من اللعاب الكامل في وعاء مبرد بالثلج. قم بتجميع كافة العينات وحفظها على الثلج.

بعد الجمع مباشرةً، انتقل إلى غرفة درجة حرارتها 4 °C مع 200 µL من اللعاب لأخذ العينات باستخدام مسابير LLUF. الآن، اغمر غشاء polyether الخلوي في اللعاب البشري داخل طبق زراعة. قم بتوليد ضغط سلبي عن طريق سحب المحقنة لمحاكاة عملية الترشيح الفائق لأخذ العينات من اللعاب.

بعد ذلك، يتم تحديد تركيزات البروتين. قم بتحضير عينات بروتين اللعاب بتركيز 1 µg/µL لتحليلها باستخدام تقنية nano lc mass spectrometry. ولتحليل العينات، نستخدم جهاز exigent nano lc مقترنًا عبر الإنترنت بمقياس طيف الكتلة Finnegan LTQ. أولاً، يتم تحميل 5 µL من عينات اللعاب غير المهضومة في عمود الحبس (trap column) الخاص بنظام nano lc بواسطة جهاز أخذ العينات التلقائي (auto sampler).

بعد خطوة الغسيل، قم بتحويل الصمام وضخ تدرج خطي من المحلول المنظم B بنسبة من 0 إلى 50% إلى المصيدة وعمود الفصل C 18. باستخدام وضع الحصول على البيانات (data dependent mode) في جهاز Excalibur، اجمع أطياف ms ms لأقوى أربعة أيونات MS تتجاوز شدتها 1 × 10⁴. لكل عينة، قم بإجراء تشغيلات مكررة لثلاث تحضيرات منفصلة ومختلفة.

بعد ذلك، يتم استيراد ملف البيانات إلى نظام sequester sorcerer two، واختيار البحث مقابل قاعدة بيانات بروتينات NCBI البشرية المناسبة باستخدام خصوصية غير إنزيمية. وبعد إجراء بحث sequester، يتم تصفية النتائج والتحقق من صحتها وعرضها تلقائياً في peptide profit و protein profit بناءً على نتائج sequester. ويقوم peptide profit بتقدير درجة احتمالية شاملة (P score) لكون تعيين الببتيدات صحيحاً مقابل كونه غير صحيح، كما يحدد معلومات إضافية عن كل تسلسل ببتيدي.

يحسب برنامج Protein profit درجة احتمالية من صفر إلى واحد لكل بروتين بناءً على الببتيدات المخصصة لأطياف Ms.Ms. يحدد هذا القسم قدرة مجسات LLUF على إزالة البكتيريا الفموية من أجل زراعة الكشف البكتيري، حيث يتم توزيع عينات اللعاب قبل وبعد جمع مجس LLUF على أطباق آجر لاختبار البكتيريا الهوائية. استخدم أطباق LB آجر الخالية من المضادات الحيوية عند 37 degrees Celsius لمدة يوم واحد، وبالنسبة للبكتيريا اللاهوائية، استخدم gas pack للزراعة.

تُحضن العينة في مرق Bru على أطباق آگار تحت ظروف لاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة يوم واحد. يسهل تصنيع أجهزة الترشيح الفائق التي تشبه المصاصة عملية أخذ عينات من اللعاب في بيئة فموية محاكية. في هذا النظام، يتم لصق غشاء بولي إيثر سلفون مشحون سلبًا بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 30 kilodaltons على مجداف من البولي بروبيلين ووضعه أمام مسبار LLUF لترشيح البروتينات الأكبر حجمًا في اللعاب.

من أجل محاكاة البيئة الفموية البشرية، يتم نقع إسفنجة في اللعاب باستخدام حقنة. ثم يُصفى اللعاب ويُجمع عبر أنبوب متصل. وقد أدت مقارنة الكروماتوغرامات السائلة (lc) للعاب قبل وبعد أخذ العينات بواسطة LLUF إلى تحديد ببتيدات اللعاب الأصلية عن طريق مطيافية الكتلة nano L-C-L-T-Q.

بما أن هذه المخططات الكروماتوغرافية التفاضلية يتم اشتقاقها دون هضم كيميائي أو إنزيمي، فإنها تبسط عملية تحضير العينات للأغراض السريرية. وفي هذه العينة، بعد توضيح LLUF لتركيبات البروتين المختلفة، تم تحديد 131 ببتيد في اللعاب غير المهضوم.

تعتبر هذه الببتيدات شظايا مشتقة من بروتينات متنوعة غنية بالبرولين. الأكتين، وألفا أميليز، وألفا 1 جلوبين، وبيتا جلوبين، وهيسوستاتين 1، والكيراتين، و1 موسين، ومستقبل immunoglobin البوليمري، والسيرين، وS 100. إن 26 ببتيداً فريداً تم تحديدها في اللعاب بعد الترشيح باستخدام مجسات LLUF هي شظايا مشتقة بشكل أساسي من بروتينات متنوعة غنية بالبرولين.

تم اكتشاف هذا الببتيد المشتق من alpha amylase حصرياً في عينة لعاب تم جمعها بدون استخدام مسابير LLUF، مما يوضح قدرة مسابير LLUF على إزالة البروتينات الكبيرة. والأكثر إثارة للاهتمام أنه بعد إزالة البروتينات الأكبر حجماً، أمكن الكشف عن عدة ببتيدات تسلسلية في عينة اللعاب التي تم جمعها باستخدام مسبار LLUF، ولا سيما الببتيدات ذات النهايات الكربوكسيلية (c termini) الغنية بالبرولين والتي تم تحديدها في العينات بعد عملية الترشيح الفائق بواسطة مسابير LLUF. ينبغي أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية استخدام A-L-L-L-L-U-F PRO لتحليل عينات اللعاب البسيطة باستخدام مطياف الكتلة.

يعد التحليل الأفضل مهمًا للغاية لجمع عينات لعاب بسيطة تحت ظروف متسقة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، أعتقد أنه يمكن تنفيذها بشكل صحيح في غضون ثلاث ساعات. إن نهج استخدام مسبار الترشيح الفائق الذي يشبه المصاصة والمقترن بـ nano L-C-L-T-Q-M-S المباشر، وتحليل سلسلة الطيف، يسهل التطبيقات السريرية للمؤشرات الحيوية في تشخيص الأمراض البشرية.