الصلبة التجميعي المرحلة من الببتيد البس Functionalized استخدام "سلامة الصيد" منهجية

الهدف العام من التجربة التالية هو تخليق ببتيد BSP وظيفي باستخدام تقنيات الطور الصلب. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تحميل حمض أميني BIS محمي على راتنج حمض هيدروكسي إيثيل بنزويك. بعد ذلك، تكرر دورات اقتران حماية عميقة لربط أحماض أمينية bis وظيفية، وهي عملية تؤدي إلى إطالة ببتيد BIS وإظهار الوظيفة المطلوبة.

أخيرًا، يتم تعديل الحمض الأميني الثنائي الأول باستخدام حمض أميني ألفا من أجل فصل ببتيد BIS عن الراتنج عن طريق تكوين DI Keto pyrazine. تم الحصول على نتائج تظهر نجاح تخليق ببتيد BSP وظيفي بنقاء خام جيد وعوائد معزولة متسقة تبلغ حوالي 10% بناءً على تحليل مطيافية الكتلة الكروماتوغرافية السائلة. وتمتد آثار هذه التقنية نحو التخليق المتوازي وتخليق مكتبات الببتيدات الثنائية لأن ببتيدات BIS يتم تجميعها على راتنج صلب، وهو ما يسهل التعامل معه مقارنة بالتفاعلات في المحلول، كما يمكن إزالة النواتج الثانوية بسهولة عن طريق الترشيح.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن العديد من الخطوات يصعب تعلمها نظراً لوجود العديد من التفاصيل المهمة والضرورية لضمان وصول جميع التفاعلات إلى مرحلة الاكتمال قدر الإمكان. وفي حالة التصنيع على طور صلب، لا توجد طريقة لتنقية المركبات الوسيطة؛ لذا، ومن أجل الحصول على منتج نهائي نقي، يجب دفع كل تفاعل إلى أقصى حد ممكن.

نوصي بإنشاء قائمة مراجعة للإجراءات التجريبية لتجنب الارتباك نظراً للطبيعة التكرارية للخطوات. يبدأ هذا البروتوكول بتحميل أول ببتيد BSP، وحماية أول ببتيد BSP مع سد الراتنج (resin capping) في آن واحد. للبدء، يتم تحميل أول ببتيد BSP عن طريق وزن 114 milligrams من راتنج H-M-B-A-A في وعاء تفاعل سعة ثمانية milliliter وإضافة قضيب تحريك مغناطيسي.

قم بتغطية الجزء العلوي من الوعاء بالسدادة المطاطية وقم بتطهير الأنبوب بغاز Argonne لمدة خمس دقائق على الأقل. وفي هذه الأثناء، قم بتحضير محلول BIS amino acid المنشط كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. وبالتزامن مع هذا الفيديو، انقل المحلول إلى وعاء التفاعل باستخدام حقنة وقم بالتحريك تحت غاز Argonne طوال الليل، وفي اليوم التالي، قم بإزالة السدادة وتصريف خليط التفاعل.

اغسل الراتنج بإضافة حوالي two milliliters من chloro methane إلى الراتنج. حرك المزيج لمدة تتراوح من 30 ثانية إلى دقيقة واحدة ثم قم بتصفيته. كرر هذه العملية أربع مرات باستخدام DCM، ثم اغسل الراتنج خمس مرات باستخدام dimethylformamide.

لإجراء الحماية العميقة للحمض الأميني ثنائي الأمين الأول وسد مسام الراتنج في آن واحد، أضف ببطء 2 mL من محلول 33% hydrogen bromide في حمض الأسيتيك وDCM إلى وعاء التفاعل. اترك المزيج ليتحرك لمدة 15 دقيقة، ثم قم بتصريف السائل وغسل الراتنج خمس مرات باستخدام DCM. كرر تسلسل الحماية D مرة أخرى.

بعد ذلك، اغسل الراتنج خمس مرات في DCM متبوعاً بخمس مرات في DMF، ثم قم بمعادلة الراتنج عن طريق غسله مرتين بمحلول D-I-P-E-A بنسبة 5% حجماً/حجماً في DMF. ثم اغسله خمس مرات بـ DCM وخمس مرات بـ DMF مرة أخرى. الآن يمكن إجراء عملية ربط الحمض الأميني الثنائي الوظيفي المحمي.

أولاً، أعد تهيئة الجو الخامل في وعاء التفاعل الذي يحتوي على الراتنج عن طريق الغسل ثلاث مرات باستخدام DCM anhydrous. ثم قم بتركيب سدادة (septum) وخط تطهير بغاز الأرجون، واغسل الوعاء بإضافة 1 إلى 2 milliliters من DCM anhydrous والتقليب لمدة 30 ثانية. بعد ذلك، قم بتصريف الوعاء حتى يبدأ الفقاع في خط الأرجون بالارتفاع.

كرر هذه العملية مرة واحدة أخرى على الأقل. بعد ذلك، قم بتحضير محلول من الحمض الأميني الثنائي الوظيفي في أنبوب اختبار مجفف باللهب تحت جو من الأرغون. أضف 47 µL من DIC وحرك المزيج لمدة 90 دقيقة.

ثم أضف 35 µL من D-I-P-E-A و 666 µL من DMF اللامائي إلى الراتنج وحركه لمدة خمس دقائق إضافية. انقل محلول حمض BIS الأميني المنشط مسبقًا إلى الوعاء باستخدام سرنجة وحركه طوال الليل حتى اليوم التالي. قم بتصريف خليط التفاعل واغسله مرتين باستخدام DCM اللامائي في ظل تدفق غاز argon.

تعد عملية ربط الأحماض الأمينية خطوة حاسمة في هذا الإجراء. ولضمان إغلاق حلقات الـ di keto piperazines، نستخدم فترات تفاعل أطول مع عوامل تنشيط إضافية. ولتعزيز إغلاق الـ di keto pyrazine، أضف محلول HOAT و DIC مع التقليب تحت غاز argon لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، قم بإزالة السدادة وتصريف خليط التفاعل. اغسل الراتنج خمس مرات باستخدام DCM وخمس مرات باستخدام DMF. يغطي هذا القسم الحماية العميقة للحمض الأميني BIS الوظيفي، والحماية العميقة لـ F moc، وأسيلة أول حمض أميني BIS.

لإجراء الحماية العميقة للحمض الأميني الثنائي الوظيفي المحمي، أضف ببطء 2 mL من محلول TFA و TIPS إلى وعاء التفاعل وقم بالتقليب لمدة ساعة واحدة، وبعد التصريف، اغسل الراتنج باستخدام DCM لمدة 30 ثانية تقريباً ثم قم بالتصريف، وكرر غسيل DCM خمس مرات. بعد ذلك، كرر تسلسل غسيل الراتنج للحماية العميقة بالكامل باتباع غسيل A-D-C-M-D-M-F. قم بمعادلة الراتنج عن طريق الغسل مرتين بمحلول 5% حجم/حجم من D-I-P-E-A في DMF.

ثم قم بإجراء غسلة أخرى بـ D-C-M-D-M-F. ومن هذه النقطة، يمكن استطالة ببتيد BIS باستخدام أحماض أمينية ثنائية وظيفية أخرى، أو وظيفته على حمض الكربوكسيل النيتروجيني الرائد، أو كليهما. ولإزالة حماية مجموعة FM، أضف محلولاً بحجم 2 mL من piperidine بتركيز 20% في DMF واخلط التفاعل لمدة 20 دقيقة.

قم بتصريف السائل وغسل الراتنج خمس مرات في DMF. كرر هذه العملية مرة أخرى بعد غسلة إضافية للراتنج. قم بعزل الحمض الأميني الثنائي الأول عن طريق إضافة محلول الحمض الأميني المُحضّر إلى وعاء التفاعل والتحريك لمدة ست ساعات كخطوة نهائية.

اغسل الراتنج خمس مرات باستخدام DCM وخمس مرات باستخدام DMF. يتضمن الجزء الأخير من هذا البروتوكول إزالة مجموعة Bach من الحمض الأميني المرتبط بالراتنج وفصله عنه. أولاً، أضف 2 mL من محلول T-F-A-D-C-M بنسبة واحد إلى واحد إلى وعاء التفاعل وحركه لمدة 30 دقيقة.

قم بتصفية الراتنج وغسله خمس مرات باستخدام DCM. ثم كرر هذه العملية مرة أخرى. اغسل الراتنج وقم بتصفيته لمدة 30 ثانية، خمس مرات باستخدام DCM وخمس مرات باستخدام DMF.

بعد ذلك، أضف 2 mL من محلول 10% D-I-P-E-A في DMF anhydrous وقم بالتقليب لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة. وأخيراً، اجمع خليط التفاعل في دورق مستدير القاع موزون مسبقاً. انقل 30 µL من هذا المحلول إلى 450 µL من Tetra Hydro FU في قارورة lc MS وقدمها للتحليل.

اغسل الراتنج بكميات إضافية من DMF واجمعها في الدورق مستدير القاع. يمكن استخدام الطرق التالية لمراقبة التحولات الكيميائية على الراتنج طوال عملية التخليق. للكشف عن مجموعات الهيدروكسيل الحرة، قم بإجراء اختبار الميثيل الأحمر عن طريق إزالة حوالي 1 mg من الراتنج الجاف أولاً باستخدام ماصة تستخدم لمرة واحدة.

اشطف المزيج في وعاء تفاعل سعة 4 mL. أضف محلول ميثيل الأحمر (methyl red) المُحضّر كما هو موضح في النص وحرك المزيج لمدة تتراوح بين 5 إلى 10 دقائق. قم بتصريف السائل وغسل الراتنج خمس مرات باستخدام DCM؛ حيث تشير حبيبات الراتنج ذات اللون البرتقالي أو الأحمر إلى وجود مجموعات هيدروكسيل حرة.

يمكن استخدام هذا الاختبار لتقييم تحميل الحمض الأميني الثنائي الأول وخطوات سد الراتنج. وللكشف عن الوسائل الثانوية، يتم إجراء اختبار الكلورال عن طريق نقل حوالي 1 mg من الراتنج الجاف إلى قارورة صغيرة باستخدام ماصة تستخدم لمرة واحدة. ثم تُضاف ثلاث قطرات من كل من محلول الكلورال بتركيز 0.8 mM في DMF ومحلول ألدهيد الحمض بتركيز 2% في DMF.

ثم نترك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. في هذه الحالة، يشير اللون الأزرق أو الأرجواني لخرز الراتنج إلى وجود مجموعات أمين ثانوية حرة على المركب المرتبط بالراتنج. ولتأكيد كفاءة التنشيط، يتم إجراء اختبار مصيدة التنشيط؛ حيث يمكن تقييم المركب المنشط أثناء عملية التخليق عن طريق نقل 5 إلى 10 µL من المحلول المنشط إلى أنبوبة كروماتوغرافيا سائلة ومطيافية كتلة (LC-MS) تحتوي على 50 µL من الـ olaine مع الخلط يدوياً.

خلال بضع ثوانٍ، يجب أن يتحول لون المحلول إلى الأصفر، ثم يُخفف بـ 450 µL من tetra hydro uran ويُقدم لتحليل lc MS. يمكن تقييم المنتج النهائي والوسائط المنشطة باستخدام نظام LCM S مجهز بعمود C 18 ذو طور معكوس ونظام مذيب يتكون من الماء والـ acetyl nitrile مع 0.1% formic acid. يوفر مخطط L-C-M-S-U-V هذا مثالاً على النقاء الجيد للمنتج الخام.

وُجد أن القمة الرئيسية في الطيف عند الدقيقة 21.3 تمتلك كتلة تتفق مع كتلة المنتج المتوقعة. ويمكن رؤية ذلك في طيف الكتلة للمنتج الخام، حيث تكشف القمة عن قمم رئيسية تتوافق مع الكتلة، مضافاً إليها كتلة أيون الصوديوم، وكذلك الكتلة مطروحاً منها كتلة مجموعة الحماية IV DDE. يظهر هنا مخطط LCMS UV للأطياف المنقاة والذي يكشف عن منتج نقي جداً عند الدقيقة 21.3، وطيف الكتلة الذي يؤكد هوية قمة هذا المنتج المنقى.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تقنيات السطح الصلب لتخليق الببتيدات الثنائية الوظيفية بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الببتيدات الثنائية لاستكشاف تطبيقات في تفاعلات البروتين-بروتين والتحفيز بمجرد إتقانها. ويمكن أن تؤدي هذه التقنية إلى تخليق ثلاثي ببتيد ثنائي وظيفي في غضون أربعة إلى خمسة أيام إذا نُفذت بشكل صحيح.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إبقاء الخرزات مغمورة في محاليل التفاعل والغسيل عند اتباع هذا الإجراء. يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التخليق المتوازي أو تخليق المكتبات من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تأثير الكيمياء الفراغية أو الوظائف البديلة على ارتباط البروتين أو النشاط التحفيزي. لا تنسَ أن العمل مع الكواشف العضوية يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل استخدام معدات السلامة الشخصية المناسبة وغطاء سحب الغازات عند تنفيذ هذا الإجراء.