الصلبة التجميعي المرحلة من الببتيد البس Functionalized استخدام "سلامة الصيد" منهجية

الهدف العام من التجربة التالية هو تصنيع ببتيد BSP الوظيفي باستخدام تقنيات الطور الصلب. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحميل حمض أميني BIS المحمي على راتنج حمض هيدروكسي إيثيل البنزويك. ثم تتكرر دورات اقتران الحماية العميقة لإرفاق الأحماض الأمينية مكرر وظيفية ، وهي عملية تطيل ببتيد BIS وتعرض الوظائف المطلوبة.

أخيرا ، يتم تعديل أول حمض أميني مكرر بحمض ألفا الأميني من أجل شق ببتيد BIS من الراتنج عن طريق تكوين DI Keto pyrazine. تم الحصول على النتائج التي تظهر التوليف الناجح لببتيد BSP الوظيفي في نقاء خام جيد وعوائد معزولة متسقة تبلغ حوالي 10٪ بناء على تحليل مطياف الكتلة للكروماتوغرافيا السائلة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو التوليف المتوازي والمكتبي للببتيدات مكرر لأن ببتيدات BIS يتم تجميعها على راتينج صلب ، والذي يمكن التلاعب به بسهولة أكبر من التفاعلات في المحلول ويمكن إزالة المنتجات الثانوية بسهولة عن طريق الترشيح.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم العديد من الخطوات نظرا لوجود العديد من التفاصيل المهمة اللازمة لضمان اقتراب جميع التفاعلات من الاكتمال قدر الإمكان. مع تخليق الطور الصلب ، لا توجد طريقة لتنقية المواد الوسيطة. لذلك من أجل الحصول على منتج نهائي نظيف ، يجب دفع كل تفاعل إلى أقصى حد ممكن.

نوصي بإنشاء قائمة مرجعية بالإجراءات التجريبية لتجنب الارتباك لأن الخطوات متكررة بطبيعتها. يبدأ هذا البروتوكول بتحميل أول ببتيد BSP ، وحماية أول ببتيد BSP وتغطية الراتنج المتزامنة. للبدء ، قم بتحميل أول ببتيد BSP بوزن 114 ملليغرام من راتنج H-M-B-A-A في وعاء تفاعل سعة ثمانية ملليلتر وإضافة قضيب تحريك مغناطيسي.

قم بتغطية الجزء العلوي من الوعاء بالحاجز المطاطي وقم بتطهير الأنبوب بالأرجون لمدة خمس دقائق على الأقل. في غضون ذلك ، قم بإعداد محلول الأحماض الأمينية BIS المنشط كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. مع هذا الفيديو ، انقل المحلول إلى وعاء التفاعل عبر المحقنة وحركه تحت الأرجون طوال الليل في اليوم التالي ، وقم بإزالة الحاجز واستنزاف خليط التفاعل.

اغسل الراتنج بإضافة ما يقرب من ملليلترين من كلورو ميثان إلى الراتنج. يقلب لمدة 30 ثانية إلى دقيقة ثم يصفى. كرر هذه العملية أربع مرات باستخدام DCM ثم اغسل الراتنج خمس مرات باستخدام ثنائي ميثيل فورماميد.

لإجراء حماية عميقة للحمض الأميني الأول مكرر وتغطية الراتنج المتزامنة ، أضف ببطء ملليلترين من محلول 33٪ بروميد الهيدروجين في حمض الخليك و DCM إلى وعاء التفاعل. اتركيه يقلب لمدة 15 دقيقة بعد تصريف الراتنج وغسله خمس مرات في DCM. كرر تسلسل الحماية D مرة أخرى.

بعد ذلك ، اغسل الراتنج خمس مرات في DCM متبوعا بخمس مرات في DMF ، وقم بتحييد الراتنج عن طريق الغسيل مرتين بمحلول حجم 5٪ من D-I-P-E-A في DMF. ثم اغسل خمس مرات باستخدام DCM وخمس مرات باستخدام DMF مرة أخرى. الآن يمكن إجراء اقتران من الأحماض الأمينية مكرر وظيفية المحمية.

أولا ، أعد إدخال جو خامل إلى وعاء التفاعل المحتوي على الراتنج عن طريق الغسيل ثلاث مرات باستخدام DCM اللامائي ثم قم بإرفاق حاجز وتطهير خط الأرجون وغسل الوعاء عن طريق إضافة واحد إلى ملليلترين من DCM اللامائي والتقليب لمدة 30 ثانية. ثم صفي الوعاء حتى يبدأ فقاعات خط الأرجون في الارتفاع.

كرر هذه العملية مرة أخرى على الأقل. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول من الأحماض الأمينية مكرر الوظيفية في أنبوب اختبار مجفف باللهب تحت جو الأرجون. أضف 47 ميكرولترا من DIC وحركه لمدة 90 دقيقة.

ثم أضف 35 ميكرولترا من D-I-P-E-A في 666 ميكرولتر و hydrus DMF إلى الراتنج وحرك لمدة خمس دقائق إضافية. انقل محلول الأحماض الأمينية BIS المنشط مسبقا إلى الوعاء عبر حقنة وحركها طوال الليل في اليوم التالي. صفي خليط التفاعل واغسليه مرتين باستخدام DCM اللامائي أثناء وجود الأرجون.

خطوة حاسمة في هذا الإجراء هي وصلات الأحماض الأمينية biz. لضمان إغلاق حلقات الكيتو بيبيرازين ، نستخدم أوقات تفاعل أطول مع عوامل تنشيط إضافية. لتعزيز إغلاق دي كيتو بيرازين ، أضف محلول HOAT و DIC مع التقليب تحت الأرجون لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الحاجز واستنزاف خليط التفاعل. اغسل الراتنج خمس مرات باستخدام DCM وخمس مرات باستخدام DMF. يغطي هذا القسم الحماية العميقة للأحماض الأمينية BIS الوظيفية ، والحماية العميقة ل F moc وأسيلة أول حمض أميني BIS.

لإجراء حماية عميقة للأحماض الأمينية مكرر المحمية ، أضف ببطء ملليلترين من محلول TFA و TIPS إلى وعاء التفاعل وحركها لمدة ساعة واحدة بعد التصريف ، اغسل الراتنج باستخدام DCM لمدة 30 ثانية ثم قم بتصريف غسل DCM المتكرر خمس مرات. ثم كرر تسلسل غسيل راتنج الحماية العميقة بالكامل بعد غسيل A-D-C-M-D-M-F. قم بتحييد الراتنج عن طريق الغسيل مرتين بمحلول حجم 5٪ من D-I-P-E-A في DMF.

ثم قم بإجراء غسيل آخر D-C-M-D-M-F. من هنا ، يمكن استطالة ببتيد BIS مع الأحماض الأمينية مكرر وظيفية أخرى أو تشغيلها على حمض النيتروجين الكربوكسيل الرائد أو كليهما. ل de حماية مجموعة FM ، أضف محلول ملليلتر من 20٪ باريدين الأنبوب في DMF واخلط التفاعل لمدة 20 دقيقة.

صفي الراتنج واغسله خمس مرات في DMF. كرر هذه العملية مرة أخرى بعد غسل إضافي للراتنج. أ يعزل أول حمض أميني مكرر عن طريق إضافة محلول الأحماض الأمينية المحضر إلى وعاء التفاعل ويقلب لمدة ست ساعات كخطوة أخيرة.

اغسل الراتنج خمس مرات باستخدام DCM وخمس مرات باستخدام DMF. يتضمن الجزء الأخير من هذا البروتوكول إزالة مجموعة باخ من الأحماض الأمينية المرتبطة بالراتنج والانقسام من الراتنج. أولا ، أضف ملليلترين من محلول T-F-A-D-C-M واحد إلى واحد إلى وعاء التفاعل وحركه لمدة 30 دقيقة.

صفي الراتنج واغسله خمس مرات في DCM. ثم كرر هذه العملية مرة أخرى. اغسل الراتنج وصفيه لمدة 30 ثانية ، خمس مرات باستخدام DCM وخمس مرات باستخدام DMF.

بعد ذلك ، أضف ملليلترين من محلول 10٪ D-I-P-E-A في DMF اللامائي وحركه لمدة 24 إلى 48 ساعة. أخيرا ، اجمع خليط التفاعل في قارورة سفلية مستديرة موزونة مسبقا. انقل 30 ميكرولترا من هذا المحلول إلى 450 ميكرولتر من Tetra Hydro FU في ملف lc MS وأرسله للتحليل.

اغسل الراتنج بكميات إضافية من DMF واجمعها في القارورة السفلية المستديرة. يمكن استخدام الطرق التالية لمراقبة التحولات الكيميائية للراتنج طوال عملية التوليف. للكشف عن مجموعات الهيدروكسيل الحرة، قم بإجراء اختبار الميثيل الأحمر عن طريق إزالة ما يقرب من ملليغرام واحد من الراتنج الجاف أولا عبر ماصة يمكن التخلص منها.

اشطفها في وعاء تفاعل سعة أربعة ملليلتر. أضف محلول ميثيل أحمر محضر كما هو موضح في النص وحركه لمدة خمس إلى 10 دقائق. صفي الراتنج واغسله خمس مرات باستخدام حبات الراتنج البرتقالية أو الحمراء DCM تشير إلى وجود مجموعات هيدروكسيل مجانية.

يمكن استخدام هذا الاختبار لتقييم تحميل أول خطوات لتغطية الأحماض الأمينية مكرر والراتنج. للكشف عن الوسائل الثانوية ، قم بإجراء اختبار الكلور عن طريق نقل ما يقرب من ملليغرام واحد من الراتنج الجاف إلى قارورة صغيرة عبر ماصة يمكن التخلص منها. أضف ثلاث قطرات من كل من 0.8 مللي مولار كلورا في محلول DMF و 2٪ ألدهيد حمض في محلول DMF.

ودعونا نجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق. في هذه الحالة ، تعد حبات الراتنج الزرقاء أو الأرجوانية مؤشرا على وجود وسائل ثانوية مجانية على المركب المرتبط بالراتنج. للتأكد من كفاءات التنشيط ، يمكن تقييم اختبار مصيدة التنشيط ، ويمكن تقييم المركب المنشط أثناء التوليف عن طريق نقل خمسة إلى 10 ميكرولتر من المحلول المنشط إلى قارورة قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة التي تحتوي على 50 ميكرولتر من الأولين الممزوج يدويا.

لبضع ثوان ، يجب أن يصبح المحلول أصفر ، ثم يخفف ب 450 ميكرولتر من رباعي الأوران المائي ويقدمه لتحليل LC MS. يمكن تقييم المنتج النهائي والوسائط المنشطة باستخدام نظام LCM S المجهز بعمود الطور العكسي C 18 ونظام مذيب من نتريل أسيتيل الماء مع حمض الفورميك 0.1٪. يوفر أثر L-C-M-S-U-V مثالا على النقاء الجيد للمنتج الخام.

تم العثور على الذروة الرئيسية في الطيف الموجودة في 21.3 دقيقة ليكون لها قناع يتوافق مع كتلة المنتج المتوقعة. يمكن تصور ذلك في الطيف الكتلي للمنتج الخام ، حيث تكشف الذروة عن قمم رئيسية تتوافق مع الكتلة ، بالإضافة إلى كتلة أيون الصوديوم ، بالإضافة إلى الكتلة مطروحا منها كتلة مجموعة حماية DDE الوريدية. يظهر هنا أثر LCMS للأشعة فوق البنفسجية للأطياف المنقاة الذي يكشف عن منتج نقي للغاية في 21.3 دقيقة وطيف الكتلة يؤكد هوية ذروة التريير المنقاة هذه.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تقنيات الوجه الصلب لتصنيع الببتيدات مكرر الوظيفية بعد تطويرها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال ببتيدات بيز لاستكشاف التطبيقات في تفاعلات البروتين والبروتين والتحفيز بمجرد إتقانها. يمكن أن تؤدي هذه التقنية إلى تخليق أداة تشذيب ببتيد بيز الوظيفية في غضون أربعة إلى خمسة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إبقاء الخرزات مغمورة في محلول التفاعل والغسيل باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل التوليف المتوازي أو المكتبي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تأثير الكيمياء الفراغية أو الوظائف البديلة على ارتباط البروتين أو النشاط التحفيزي. لا تنس أن العمل مع الكواشف العضوية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام معدات السلامة الشخصية المناسبة وغطاء الدخان عند تنفيذ هذا الإجراء.