الحمض النووي الريبي التدخل ناقلات القائم على دراسة وظيفة الجينات في سرطان

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وظيفة الجين من خلال استخدام تداخل الحمض الريبوزي (RNA interference) القائم على ناقلات DNA. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصميم وتوليد بنى S-H-R-N-A التي تستهدف جينات محددة. وتتمثل الخطوة الثانية في إنتاج فيروس لينتي (lentivirus) يحمل كاسيت التعبير عن SH RNA.

بعد ذلك، يتم إنشاء خطوط خلوية مستقرة عن طريق إصابة الخلايا بالفيروس البطيء (lentivirus)، وتُستخدم الخلايا المصابة بالفيروس البطيء في فحوصات متنوعة مخبرياً (in vitro) وحيوياً (in vivo) لتحديد آثار إسكات الجين المستهدف. وفي النهاية، وبناءً على الفحوصات المستخدمة، يمكن أن تظهر النتائج تغيرات في القدرة التورمية للخلايا نتيجة تثبيط الجين، وذلك من خلال استخدام فحوصات التكاثر والهجرة والغزو مخبرياً (in vitro)، بالإضافة إلى نماذج تكوين الطعوم الغريبة (xenograft) حيوياً (in vivo). سيقوم بتوضيح الإجراء Daniel Stowell وma Juan، حيث أن Daniel طالب دراسات عليا في مختبري، وMa Ma فني مختبر.

تشانج باحث في مرحلة ما بعد الدكتوراه. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أبحاث السرطان، مثل ما إذا كان لجين معين دور في تطور السرطان وتفاقمه، وما هي جوانب هذه العمليات التي قد يكون مهماً بالنسبة لها. للبدء، قم بتصميم وطلب قليلات النيوكليوتيد بناءً على المعايير الموصوفة، وهي عبارة عن اثنين من قليلات النيوكليوتيد المتكاملة عكسياً والتي تحتوي على التسلسل المستهدف المكون من 20 إلى 23 نيوكليوتيد في الجين المستهدف.

سوف تشكل هذه المواقع مواقع EcoRI وHindIII عند الطرفين. وبعد إجراء عملية التخمير (annealing)، يتم دمج أوليغو آخر يحتوي على تسلسل مكمل عكسي للتسلسل المستهدف، حيث يرتبط طرفه '3 بالطرف '3 للمروج H1 أو U6 باستخدام بادئ علوي (upstream primer).

استخدم تفاعل PCR لإنتاج قطعة تحتوي على مواقع القطع BAM H one و Hindi three عند كل طرف. وفي هذه الأثناء، قم بهضم ناقل الفيروس البطيء (lentivirus vector) وقطعة PCR. بعد ذلك، قم بإجراء تفاعل ربط لثلاث قطع بين الناقل وقطعة PCR وأوليغو نيوكليوتيدات Anil.

عند نسبة مولارية تبلغ 1 إلى 10، سينتج الناقل الناتج HRNA المستهدف مع تسلسل Hindi three في منطقة الحلقة. وفي حال استخدام ناقل قابل للاستحثاث، سيعتمد إنتاج HRNA على وجود جزيء محفز مثل doxycycline لنظام Tet on. والآن، قم بتحويل خلايا e coli DH five alpha ذات الكفاءة العالية والمؤهلة باستخدام ناتج الربط، وحدد النواقل الإيجابية باستخدام فحص PCR القائم على المستعمرات.

قم بتضخيم ناتج يمتد ليشمل الناقل وموقع ربط المحفز القابل للاستحثاث. قم بتحضير DNA البلازميد من المستعمرات الموجبة باستخدام طقم تجاري. ثم أكد وجود القطعة المدرجة عن طريق الهضم باستخدام BAM H one و ECO R one وعن طريق الفصل الكهربائي لـ DNA على هلام الأغاروز.

بالإضافة إلى ذلك، يتم تحديد تسلسل المنطقة التي تحتوي على المحفز وS-H-R-N-A باستخدام LIGA nucleotide P five. وباستخدام طقم تحضير MIDI أو maxi prep خالٍ من السموم الداخلية، يتم تحضير الحمض النووي DNA للفيروس البطيء (lentivirus) الذي يحمل كاسيت تعبير HRNA. يتم تحديد تركيز DNA عن طريق قياس امتصاص الضوء عند 260 nanometers، والتأكد من نقاء DNA من خلال التحقق من أن نسبة امتصاص الضوء بين 260 إلى 280 nanometers تتراوح بين 1.8 و2.0.

أخيراً، قم بتشغيل بلازميد الفيروس البطيء (lentivirus plasmid) على هلام هوائي (aero gel) للتأكد من أنه ملتف بشكل فائض (S coiled). قبل عملية التعداء (transfection)، استعد للتعداء عن طريق إضافة 0.9 milliliters من المحلول A ببطء إلى 0.9 milliliters من المحلول B، مع ضخ الهواء عبر المحلول B باستخدام ماصة. بعد ذلك، قم بتحضين الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم، أضف ببطء 0.6 milliliters من الخليط إلى ثلاثة أطباق مختلفة بقطر 10 centimeter تحتوي على خلايا HEK 2 93 T.

ثم أعد الخلايا إلى الحاضنة بعد مرور أربع إلى ست ساعات. استبدل الوسط بـ 7 mL من وسط DMEM الكامل. بعد 24 ساعة، أضف 5 mL إضافية من الوسط، وبعد 24 ساعة أخرى، قم بحصاد الوسط الذي يحتوي على الفيروس البطيء (lentivirus).

قم بطرد الوسط الذي تم حصاده مركزياً بسرعة 1500 RPM في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بترشيح السائل الطافي باستخدام مرشح بمقاس 0.45 micrometer. قم بطرد الوسط المترشح الذي يحتوي على الفيروس البطيء (lentivirus) مركزياً باستخدام جهاز الطرد المركزي الفائق (ultra centrifugation).

قم بسكب السائل الطافي في حاوية نفايات تحتوي على مبيض بتركيز 5%. أعد تعليق كريّة الفيروس البطيء في نصف ملليلتر إلى ملليلتر واحد من 1X PBS البارد. بعد ذلك، قسم محلول الفيروس البطيء إلى حصص تتراوح بين 50 إلى 100 µL للتخزين عند درجة حرارة -80 °C.

أخيراً، حدد عيار الفيروس البطيء باستخدام تقنية موثوقة. عادةً ما ينتج طبق استنبات بقطر 10 سنتيمتر ما بين 50 إلى 100 مليون وحدة معدية قبل البدء في عملية إصابة الخلايا. حدد تعددية العدوى (MOI) لعيار الفيروس البطيء باستخدام طقم اختبار أو تقنية R-T-P-C-R لهذا الإجراء.

يُوصى باستخدام مُتعددية عدوى (MOI) أقل من أربعة. ابدأ بزراعة الخلايا المراد إصابتها في طبق ذي ستة آبار بكثافة تتراوح بين 30 إلى 40% واستنبتها طوال الليل. في اليوم التالي.

استبدل الوسط بـ 1 mL من وسط طازج يحتوي على poly brain أو protamine. ثم أضف ما بين 1 و 2 million iu من lentivirus يحتوي على علامة فلورية أو علامة مضاد حيوي.

رجّ الطبق ببطء لمدة 10 ثوانٍ لخلط المكونات، ثم حضّنه لمدة ست ساعات. بعد مرور ست ساعات، استبدل الوسط بوسط غذائي كامل وعادي، وقم بإكثار الخلايا لمدة يومين. يجب ألا يحتوي الوسط الغذائي على مضادات حيوية أو محفزات بغض النظر عن نوع الفيروس البطيء (lentivirus) المستخدم بعد مرور اليومين.

أضف المضاد الحيوي المناسب إذا كان الفيروس البطيء (lentivirus) يحتوي على علامة مضاد حيوي. وبالمثل، أضف المادة المحفزة إلى نصف المزارع إذا كان الفيروس البطيء قابلاً للتحفيز. بعد استزراع الخلايا لمدة يومين أو ثلاثة أيام إضافية مع المضادات الحيوية والمحفزات، قم بإجراء تحليل ويسترن بلوت (western blot) لاختبار تثبيط الجين المستهدف قبل إجراء عملية نقل الطعم الغريب (xenograft) باستخدام التربسين.

تُنقل الخلايا من أطباق زراعة الخلايا الكبيرة وتُعلق مجدداً في الوسط الأصلي الذي يحتوي على 50%matrigel. من الضروري الحفاظ على الخلايا السرطانية المعلقة في 50%matrigel وعلى السرنجة فوق الثلج؛ وإلا، هناك خطر من تصلب matrigel مما سيضطر الباحث لإعادة العملية من البداية.

قم بتجهيز موقع الجراحة من خلال تنظيفه جيداً باستخدام 70%ethanol وأجرِ التخدير مع ضمان تهوية ممتازة وتركيب مرشح لتنقية isof fluorine في غرفة التحريض. قم بتخدير فئران thymic nude باستخدام 2%isof fluorine ممزوجاً مع 1.5%oxygen قبل ثلاث إلى خمس دقائق من تلقيح الخلايا. ثم حافظ على التخدير باستخدام 2%isof fluorine ممزوجاً مع oxygen عبر قناع أنفي.

ضع الفأر على وسادة تدفئة مضبوطة عند 30 درجة Celsius. قم بتحميل الخلايا في محاقن مزودة بإبر مقاس 25.5 للحقن تحت الجلد، أو إبر مقاس 28 إلى 30 للحقن في الموقع الأصلي (orthotopic). بعد خمس دقائق من تحريض التخدير في موقع واحد أو موقعين، احقن من مليون إلى 10 ملايين خلية في جرعات مقدارها 200 microliter.

يعتمد عدد الخلايا على مدى خباثة أو شراسة الخلايا السرطانية. بالنسبة للنواقل النشطة بنيوياً، استخدم مجموعتين من الفئران يتم حقنهما بخلايا تعبر إما عن الجين المستهدف S-H-R-N-A أو عن S-H-R-N-A عشوائي التسلسل على النواقل. استخدم المجموعتين ذاتهما وقم بتقسيم كل منهما إلى مجموعات فرعية يتم تزويدها أو لا يتم تزويدها بالمحفز في مياه الشرب.

استبدل المياه في أوعية الشرب مرتين أسبوعياً. راقب حجم الأورام أسبوعياً أو كل أسبوعين باستخدام الفرجار. تأكد من أن حجم الورم لا يتجاوز الحد المسموح به من قبل المؤسسة أو لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسي للحيوانات (IACUC)، وقم بقتل أي حيوانات تظهر عليها تقرحات واسعة، أو تنخر، أو عدوى واضحة، أو نزيف غير منضبط، أو مرض في مراحله النهائية. ولمراقبة نمو الورم وانتقاله عبر علامة ذات ضيائية حيوية، قم بتطهير منطقة العمل وتخدير الفئران في غرفة التصوير باستخدام التخدير الغازي.

أولاً، قم بإجراء تعريض لمدة تتراوح من دقيقتين إلى خمس دقائق وتحقق من شدة الإشارة ثم قم بالتعديل وفقاً لذلك. إذا تجاوز حجم الورم 1000 cubic millimeters أو الحد المسموح به في المؤسسة، يتم قتل الحيوان رحيماً عند التضحية به، وتوثيق حجم الورم والاحتفاظ به لإجراء المزيد من التحليلات. استُخدم هذا البروتوكول لدراسة تأثيرات تثبيط why Y one على تكوين أورام طعوم غريبة من خلايا سرطان الثدي البشري الغدية التي تعبر عن luciferase والمزروعة في فئران عارية عديمة التيموس.

تم اختبار كل من تسلسل S-H-R-N-A المستهدف لبروتين YY1 البشري وS-H-R-N-A ضابط عشوائي، والذي لم يظهر تشابهاً ملحوظاً مع أي نسخ بشرية معروفة. ونتيجة لذلك، تم بناء ناقلين من الفيروسات البطيئة واستخدامهما لإنتاج فيروسين بطيئين. استُخدم كلاهما لإصابة مجموعتين مختلفتين من الخلايا، وتم الحصول على مجموعات خلوية متعددة النسائل.

بعد الانتخاب باستخدام الـ purmycin، أكد تحليل Western blot تثبيط YY1 الناجم عن DS في هذه الخطوط الخلوية المصابة. بعد ذلك، تم استخدام المجموعة الخلوية متعددة النسائل للكلون رقم ثلاثة التي أُصيبت بـ inducible YY1 shRNA والـ control shRNA.

استُخدمت الفيروسات البطيئة (LENTIVIRUSES) لاختبار تأثيرات استنزاف YY one على الغزو. وقد لاحظنا أن استنزاف YY one قلل من القدرة الغزوية للخلايا. وأكد تحليل Western blood أن المستحثات أدت إلى إسكات YY one في الخلايا التي تحتوي على YY one S-H-R-N-A المستحث، بينما الخلايا التي تحتوي على التحكم.

ولم تظهر S-H-R-N-A هذا التأثير. استُخدمت هذه الخلايا بعد ذلك في دراسة نموذج طعم غريب في الفئران مقارنة بمجموعات التحكم indu، حيث أظهرت الفئران المزروعة بـ S-H-R-N-A والتي تم تزويدها بالماء المحتوي على dos انخفاضاً ملحوظاً في تكوين الأورام عند التصوير بالتلألؤ البيولوجي وعند قياس أوزان الأورام كما كان متوقعاً. كما تم تأكيد إسكات YY one في هذه الأورام المزروعة بسهولة عن طريق لطخة ويسترن.

الدراسات لا تنسَ أن العمل مع الفيروسات البطيئة (lentivirus) يمكن أن يكون خطيراً للغاية وفقاً لاعتبارات السلامة الخاصة بـ NIHB للبحوث التي تستخدم ناقلات الفيروسات البطيئة، حيث يتطلب الأمر اتباع إجراءات احتواء المستوى الثاني من السلامة البيولوجية (B safety level two) في جميع المختبرات.