الحمض النووي الريبي التدخل ناقلات القائم على دراسة وظيفة الجينات في سرطان

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وظيفة الجينات من خلال استخدام تداخل الحمض النووي الريبي القائم على نواقل الحمض النووي. يتم تحقيق ذلك من خلال تصميم وإنشاء تركيبات S-H-R-N-A التي تستهدف جينات معينة. الخطوة الثانية هي إنتاج فيروس العدسات الذي يحمل كاسيت تعبير الحمض النووي الريبي SH.

ثم يتم إنشاء خطوط الخلايا المستقرة عن طريق إصابة الخلايا بفيروس العدسي وتستخدم الخلايا المصابة بالعدسات في مختلف المقايسات في المختبر وفي الجسم الحي لتحديد آثار إسكات الجين محل الاهتمام. في النهاية ، اعتمادا على المقايسات المستخدمة ، يمكن أن تظهر النتائج تغيرات في عبقرية الورم في الخلايا نتيجة للضربة القاضية الجينية من خلال استخدام فحوصات التكاثر والهجرة والغزو في المختبر ، وكذلك نماذج تكوين الطعم الطبيعي في الجسم الحي. سيتم توضيح الإجراء دانيال ستويل ، ما خوان ، ودانيال طالب دراسات عليا في مختبري Ma Ma فني.

تشانغ زميل ما بعد الدكتوراه. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث السرطان ، مثل ما إذا كان لجين معين دور في تطور السرطان وتطوره ، وما هي جوانب هذه العمليات التي قد تكون مهمة لها. للبدء في تصميم وترتيب قليل النوكليوتيدات بناء على المعايير الموصوفة ، أنيل الأوليغوزيتين التكميليتين العكسية اللتين تحتوي على التسلسل المستهدف من 20 إلى 23 نيوكليوتيدات في الجين المستهدف.

سيشكلون مواقع eco R one و Hindi ثلاثة مواقع في الطرفين. بعد أن ركع ، يحتوي أوليغو آخر على تسلسل تكميلي عكسي للتسلسل المستهدف ، ونهايته الأولية الثلاثة. نيلز إلى الطرف الرئيسي الثلاثة من مروج H one أو U six مع برايمر المنبع.

استخدم PCR لإنشاء جزء يحتوي على BAM H واحد وثلاثة مواقع هندية على كلا الطرفين. وفي الوقت نفسه ، هضم ناقل الفيروس العدسي وجزء PCR. ثم قم بإجراء تفاعل ربط ثلاثي الأجزاء بين الناقل وجزء تفاعل البوليميراز المتسلسل ونيوكليوتيدات أنيل أوليغو.

عند نسبة واحد إلى 10 إلى 10 مولار ، سينتج المتجه الناتج HRNA محل الاهتمام مع تسلسل هندي ثلاثي في منطقة الحلقة. إذا تم استخدام ناقل محفز ، فإن إنتاج HRNA سيتوقف على وجود جزيء محفز مثل الدوكسيسيكلين لنظام Tet on. الآن قم بتحويل الهوية القولونية عالية الكفاءة والكفاءة DH خمس خلايا ألفا باستخدام المنتج المرتبط وتحديد النواقل الإيجابية باستخدام شاشة PCR القائمة على المستعمرة.

تضخيم منتج يمتد على الناقل وموقع ربط المحفز المحفز. تحضير الحمض النووي للبلازما من المستعمرات الإيجابية باستخدام مجموعة تجارية. ثم تأكد من وجود الإدخال بواسطة BAM H واحد و ECO R هضم واحد وعن طريق الرحلان الكهربائي للحمض النووي agarose.

بالإضافة إلى ذلك ، قم بتسلسل المنطقة التي تحتوي على المحفز و S-H-R-N-A باستخدام نيوكليوتيدات LIGA P خمسة. باستخدام مجموعة MIDI أو مجموعة إعداد ماكسي خالية من السموم الداخلية ، قم بإعداد الحمض النووي للفيروس العدسي الذي يحمل كاسيت تعبير HRNA. حدد تركيز الحمض النووي عن طريق قياس امتصاص الضوء عند 260 نانومتر وتأكد من نقاء DN a عن طريق التحقق من أن نسبة امتصاص الضوء من 260 إلى 280 نانومتر تتراوح بين 1.8 و 2.0.

أخيرا ، قم بتشغيل بلازميد فيروس العدسات على هلام هوائي للتأكد من أنه ملفوف S قبل التعداء ، استعد للتعداء عن طريق إسقاط 0.9 مل من المحلول A ببطء أولا في 0.9 مل من المحلول B أثناء فقاعات الهواء عبر المحلول B باستخدام ماصة. ثم احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإسقاط 0.6 مل من الخليط ببطء على ثلاث ألواح مختلفة بحجم 10 سم مع خلايا HEK 2 93 T.

ثم أعد الخلايا إلى الحاضنة بعد أربع إلى ست ساعات. استبدل الوسط بسبعة ملليلتر من وسط DMEM الكامل. بعد 24 ساعة ، أضف خمسة ملليلتر أخرى من الوسط ، وبعد 24 ساعة أخرى ، احصد الوسط الذي يحتوي على فيروس العدس.

قم بتدوير الوسط المحصود بسرعة 1500 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بتصفية المادة الطافية باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر. قم بتدوير التدفق عبر الوسط الذي يحتوي على فيروس العدسات عن طريق الطرد المركزي الفائق.

صب المادة الطافية في حاوية نفايات تحتوي على 5٪ مبيض. يعلق بيليه العدسات في نصف إلى واحد مليلتر من البارد واحد XPBS. ثم قسم محلول العدسات إلى 50 إلى 100 ميكرولتر من الحصص للتخزين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

أخيرا ، حدد عيار الفيروس العدسي باستخدام تقنية موثوقة. عادة ما ينتج طبق استزراع 10 سم من 50 إلى 100 مليون وحدة معدية قبل الشروع في الإصابة بالخلايا. حدد وزارة الداخلية لعيار الفيروس العسسي باستخدام مجموعة أو R-T-P-C-R لهذا الإجراء.

يوصى بوزارة الداخلية أقل من أربعة. ابدأ بزرع الخلايا المراد إصابتها في صفيحة من ستة آبار إلى 30 إلى 40٪ من الطلاقة المشتركة وزراعتها بين عشية وضحاها. في اليوم التالي.

استبدل الوسط بملليلتر واحد من الدماغ الطازج المتوسط أو البروتامين. ثم أضف ما بين واحد و 2 مليون وحدة دولية. فيروس عدسي يحتوي على علامة فلورية أو مضاد حيوي.

رج الطبق ببطء لمدة 10 ثوان لخلطه واحتضانه لمدة ست ساعات. بعد ست ساعات ، استبدل الوسط بوسط طبيعي كامل ، ونشر الخلايا لمدة يومين. يجب ألا تحتوي الوسائط على مضادات حيوية أو محفزات بغض النظر عن الفيروس العدسي المستخدم بعد يومين.

أضف المضاد الحيوي المناسب إذا كان الفيروس يحتوي على علامة مضاد حيوي. وبالمثل ، أضف المحفز إلى نصف الثقافات إذا كان الفيروس المحفز. بعد زراعة الخلايا لمدة يومين أو ثلاثة أيام أخرى باستخدام المضادات الحيوية والمحفزات ، قم بإجراء تحليل دم غربي لاختبار ضربة قاضية للجين المستهدف قبل عيون التربسين xenograft.

الخلايا من أطباق زراعة الخلايا الكبيرة وتعليقها في وسط أصلي يحتوي على 50٪ ماتريجل. من الضروري الحفاظ على تعليق الخلايا السرطانية وفي 50٪ ماتريجل والحقنة على الجليد. خلاف ذلك ، هناك خطر من أن تصلب matrigel وسيتعين على العدوى AB حيال ذلك.

قم بإعداد موقع الجراحة عن طريق تنظيفه جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول وإجراء التخدير بتهوية ممتازة وفلتر زبال الفلور المتصل بغرفة الحث. تخدير الفئران العارية الصعترية باستخدام 2٪ من الفلور الممزوج ب 1.5٪ أكسجين قبل ثلاث إلى خمس دقائق من تلقيح الخلايا. ثم حافظ على التخدير باستخدام 2٪ من الفلور الممزوج بالأكسجين من خلال مخروط الأنف.

ضع الماوس على وسادة تسخين مضبوطة على 30 درجة مئوية. قم بتحميل الخلايا في محاقن بمقياس 25 وإبر نصف للحقن تحت الجلد ، أو 28 إلى 30 إبرة قياس لحقن تقويم العظام. بعد خمس دقائق من تحريض التخدير في موقع أو موقعين ، قم بحقن خلية واحدة إلى 10 ملايين خلية في 200 جرعة ميكرولتر.

يعتمد عدد الخلايا على الأورام الخبيثة أو عدوانية الخلايا السرطانية. بالنسبة للنواقل النشطة بشكل أساسي ، استخدم مجموعتين من الفئران المحقونة بالخلايا التي تعبر إما عن الجين المستهدف S-H-R-N-A أو حصن S-H-R-N-A مخلوطة على المتجهات. استخدم نفس المجموعتين وقسمهما إلى مجموعات فرعية يتم توفيرها أو لا يتم توفيرها في مياهها.

استبدل المستندات التي تحتوي على الماء مرتين في الأسبوع. راقب حجم الأورام أسبوعيا أو كل أسبوعين باستخدام C.تأكد من أن حجم الورم لا يتجاوز الحد المؤسسي أو A CUC وقتل أي تظهر تقرحا شديدا أو عدوى نخر واضحة أو نزيف غير منضبط أو مرض في المرحلة النهائية. لمراقبة نمو الورم والورم الخبيث عبر علامة الإضاءة الحيوية ، قم بتطهير منطقة العمل وتخدير الفئران في غرفة التصوير بالتخدير الغازي.

أولا ، قم بإجراء تعريض ضوئي من دقيقتين إلى خمس دقائق وتحقق من شدة الإشارة ثم اضبطها وفقا لذلك. إذا تجاوز حجم الورم 1000 ملليمتر مكعب أو حد الحجم المؤسسي ، فقم بتوثيق حجم الورم واحتفظ به لمزيد من التحليل. تم استخدام هذا البروتوكول لدراسة آثار سبب ضربة قاضية Y واحدة على تكوين ورم xenograft لوسيفيراز يعبر عن خلايا سرطان غدي الثدي البشري المزروعة في الفئران العارية الرياضية.

تم اختبار كل من التسلسل المستهدف S-H-R-N-A ل YY البشري والتحكم المخفوق S-H-R-N-A ، والذي لم يكن له تشابه كبير مع أي نسخة بشرية معروفة. نتيجة لذلك ، تم إنشاء ناقلين للفيروسات العدسية واستخدامهما لإنتاج فيروسين. تم استخدام كلاهما لإصابة مجموعتين مختلفتين من الخلايا وتم الحصول على مجموعات خلايا متعددة النسيلة.

بعد اختيار المايسين. أكد تحليل الدم الغربي أن DS تسبب في ضربة قاضية في خطوط الخلايا المصابة هذه. بعد ذلك ، مجموعة الخلايا متعددة النسيلة من استنساخ ثلاثة التي أصيبت ب YY واحد محفز S-H-R-N-A والسيطرة. S-H-R-N-A.

تم استخدام فيروسات LENTI لاختبار آثار استنفاد YY واحد على الغزو. لاحظنا أن استنفاد YY واحد قلل من غزو الخلايا. أكد تحليل الدم الغربي أن المستندات تسبب YY واحد في إسكات الخلايا مع indu YY واحد S-H-R-N-A ، بينما الخلايا التي تحتوي على تحكم.

يظهر S-H-R-N-A هذا التأثير. ثم تم استخدام هذه الخلايا في دراسة نموذج الفئران الغريبة مقارنة بالمجموعات الضابطة indu ، أظهرت الفئران المزروعة S-H-R-N-A المزودة ب DOS التي تحتوي على الماء انخفاضا كبيرا في تكوين الورم عند تصورها عن طريق التلألؤ البيولوجي وعندما تم قياس أوزان الورم كما هو متوقع. YY تم تأكيد إسكات واحد في أورام الطعم الغريب هذه بسهولة بواسطة اللطخة الغربية.

الدراسات: لا تنس أن العمل مع فيروس العدسي يمكن أن يكون خطيرا للغاية وفقا لاعتبارات السلامة الخاصة بالمعاهد الوطنية للصحة والسلامة للبحوث المتعلقة بنواقل الفيروسات العدسية المعززة من مستوى السلامة B ، ويلزم إجراء الاحتواء الثاني لجميع إعدادات المختبر.