الماوس جزيرة من العزلة انجرهانز باستخدام مزيج من كولاجيناز تنقية والبروتياز متعادلة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل جزر لانجرهانز بنجاح من بنكرياس الفأر. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل البنكرياس عن الأنسجة المحيطة به. بعد ذلك، يتم قسطرة القناة الصفراوية بحيث يمكن نفخ البنكرياس بمزيج الكولاجيناز والبروتياز.

بمجرد تضخيم العضو، يتم استئصال البنكرياس وفصل الجزرهاوية بعناية. وفي النهاية، يتم ترشيح الجزرهاوية المعزولة وزراعتها في أطباق لاستخدامها لاحقاً. وفي المجمل، تُستخدم هذه الطريقة في عزل الجزرهاوية باستخدام الكولاجيناز المنقى والبروتياز المتعادل لتحقيق أقصى عائد من الجزرهاوية والحصول على شكل مورفولوجي مثالي لها.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية لعزل جزر لانجرهانز في أننا تخلصنا من التباين بين التشغيلات المختلفة من خلال استخدام إنزيمات منقاة. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتعديل أو تحسين بعض البروتوكولات لتحسين شكل ومورفولوجيا جزر لانجرهانز. بعد القتل الرحيم، قم بتغطية الجذع بـ 70%ethanol قبل فتح التجويف البطني بالكامل من الشرج إلى الحجاب الحاجز.

ضع الفأر بعد ذلك على منصة مجهر التشريح. اسحب الأعور والقولون الصاعد وضعهما خارج تجويف الجسم إلى اليسار، ثم أزِح فصوص الكبد باتجاه الحجاب الحاجز. وإذا لم تستقر الفصوص في مكانها تلقائياً، قم بتوسيع فتحة تجويف الجسم.

أمسك الاثني عشر باستخدام ملاقط منحنية وحدد حزمة الشريان الكبدي والوريد البابي والقناة الصفراوية المؤدية إلى الكبد. وباستخدام زوج آخر من الملاقط المنحنية، أدخل غرزة جراحية أسفل حزمة الشريان والوريد والقناة، ثم أحكم ربطها في أقرب نقطة ممكنة من الكبد.

باستخدام زوجين من الملاقط المنحنية، أمسك الاثني عشر بعناية وحدد موقع القناة الصفراوية المتصلة عند الحليمة. استخدم طرفاً واحداً من الملقط للثقب عبر البنكرياس والأنسجة الضامة مباشرة أسفل القناة الصفراوية وبالقرب من الحليمة. وبسرعة، مرر الملقط عبر الثقب وأدخل خيط جراحي. اربط الخيط بشكل فضفاض حول القناة الصفراوية لإنشاء دائرة صغيرة باستخدام ملقط بزاوية 90 درجة.

اسحب الأمعاء الدقيقة حتى يصبح القناة الصفراوية مشدودة. قم بإجراء قطع أفقي واحد عبر الحليمة باستخدام مقص دقيق للغاية دون إزاحة القناة الصفراوية من الحليمة أثناء إمساك الأمعاء. أدخل كانيولا في القناة الصفراوية ثم اسحب الغرزة بلطف لشدها حول الكانيولا.

بعد ذلك، املأ سرنجة سعة ثلاثة مليلتر بـ 2.0 مليلتر من خليط إنزيم الكولاجيناز البروتيني. احقن هذا الخليط في الكانيولا بمعدل بطيء وثابت. بعد اكتمال انتفاخ البنكرياس، قم بإزالة الكانيولا من القناة الصفراوية.

بدءاً من القولون النازل، قم بقص النسيج الضام مع سحب الأمعاء للأعلى حتى الوصول إلى القناة الصفراوية. بعد ذلك، افصل البنكرياس عن الطحال والأنسجة المحيطة. وأخيراً، اقطع الغرز وأخرج البنكرياس.

بعد الاستئصال، ضع البنكرياس في أنبوب سعة 50 milliliter يحتوي على خمسة milliliters من HBSS على الثلج. وبمجرد جمع جميع العينات، ضع أي أنابيب سعة 50 milliliter تحتوي على أنسجة البنكرياس في حمام مائي بدرجة حرارة 37 degree Celsius. قم بهز الأنبوب برفق لمدة 15 دقيقة وتحقق من تفكك الأنسجة.

تأكد من أن الأنسجة تتفكك بسهولة أثناء إمساك الأنبوب من الغطاء. قم بتدوير الأنبوب 12 مرة لزيادة تفكيك الأنسجة. أضف ما لا يزيد عن 30 milliliters من HBSS ثم قم بالطرد المركزي.

قم بشفط السائل الطافي بعناية مع ترك كمية صغيرة منه في القاع لتجنب تشتيت كتلة الخلايا. وباستخدام حقنة سعة 30 milliliter متصلة بإبرة قياس 14 gauge، أضف ما لا يزيد عن 10 milliliters من HBSS وقم بشفط المعلق للأعلى وللأسفل مرتين. قم بترشيح خليط الخلايا عبر مصفاة T بلاستيكية في أنبوب سعة 50 milliliter.

اشطف بـ 10 milliliters أخرى من HBSS ثم استخدم جهاز الطرد المركزي. صب السائل الطافي واقلب الأنابيب لتصريف السوائل على مناديل ورقية ماصة لمدة دقيقة واحدة. أعد تعليق محتوى كل أنبوب في 10 milliliters.

تبريد عند 1100. غطاؤه غير الشفاف، غير الشفاف الخاص به مع 10 ملليلتر من HBSS والطرد المركزي. قم بإزالة كامل الـ 20 ملليلتر من الرائق باستخدام ماصة ذات فتحة واسعة سعة 25 ملليلتر، ومرر الرائق عبر مرشح مقلوب بمسامية 70 ميكرون.

قم بترشيح العيينات مباشرة في طبق بتري، ثم اشطفها عن طريق سحب 10 milliliters من وسط نمو العيينات عبر المزرعة المرشحة. تُحفظ العيينات في حاضنة زراعة الأنسجة حتى يحين وقت التجربة. وتعد إنتاجية العيينات وشكلها وجودتها هي المعايير العامة المستخدمة للحكم على نجاح عملية عزل العيينات.

يظهر هنا المورفولوجيا النموذجية لجزر لانجرهانز. وتتميز هذه الجزر بشكل يتراوح بين الدائري والبيضاوي مع حجم متجانس نسبياً. هنا، تم تحليل جزر لانجرهانز المعزولة لقياس إفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز.

كان تحفيز الإنسولين متشابهاً بين جزر لانجرهانز المُحضرة باستخدام Sigma Type 11 مقارنة بـ ci zyme TM, MABP، مما يشير إلى جودة عالية في تحضير الجزر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قسطرة القناة الصفراوية للفأر. استخدم zyme collagenase والبروتيازات المتعادلة لعزل الجزر الخاصة بك لأي مقايسة.