الماوس جزيرة من العزلة انجرهانز باستخدام مزيج من كولاجيناز تنقية والبروتياز متعادلة
سبتمبر 7, 2012
يوصف وصفا مفصلا لعزل جزيرة الماوس باستخدام تقنية في كيفية تركيب الكانيولا في البنكرياس القنوي الموقع ونضح من مجموعة من تنقية الأنزيم البروتيني كولاجيناز ومحايدة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الثقوب بنجاح من البنكرياس الفأر. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل البنكرياس أولا عن الأنسجة المحيطة. بعد ذلك ، يتم تقبل القناة الصفراوية بحيث يمكن نفخ البنكرياس بخليط البروتياز الكولاجيناز.
بمجرد نفخها ، تتم إزالة البنكرياس وفصل الثقوب بعناية. أخيرا ، يتم ترشيح الثقوب المعزولة وطلاءها لاستخدامها في المستقبل. في النهاية ، يتم استخدام طريقة عزل العيينة هذه مع الكولاجيناز المنقى والبروتياز المحايد للحصول على أقصى إنتاجية للعيينة ومورفولوجيا العيينة المثلى.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية لعزل العيينة هي أننا تخلصنا من التباين الكبير باستخدام الإنزيمات المنقاة. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتغيير أو إجراء تحسينات على بعض البروتوكولات لتحسين مورفولوجيا العيون. بعد القتل الرحيم ، قم بتغطية الجذع بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل فتح تجويف البطن بالكامل من فتحة الشرج إلى الحجاب الحاجز.
بعد ذلك ، ضع الماوس على منصة مجهر التشريح. اسحب الأعور والقولون الصاعد وضعهما خارج تجويف الجسم إلى اليسار لإزاحة فصوص الكبد مقابل الحجاب الحاجز. إذا لم يبقوا هناك بمفردهم ، فقم بزيادة فتحة تجويف الجسم.
امسك الاثني عشر بالملقط المنحني وحدد موقع بوابة الشريان الكبدي والوريد والقناة الصفراوية المؤدية إلى الكبد. مع زوج آخر من الملقط المنحني. أدخل خياطة أسفل الوريد الشرياني وحزمة القناة وشدها بالقرب من الكبد قدر الإمكان.
باستخدام زوجين من الملقط المنحني ، أمسك الاثني عشر بعناية وابحث عن القناة الصفراوية المرفقة في الحليمة ، استخدم ملقطا واحدا من الملقط للوخز في البنكرياس والأنسجة الضامة أسفل القناة الصفراوية مباشرة وبالقرب من الحليمة تعمل. بسرعة ، ضع الملقط من خلال الفتحة وأدخل خياطة. فضفاضه. اربط الخيط حول القناة الصفراوية لإنشاء دائرة صغيرة باستخدام ملقط 90 درجة.
اسحب الأمعاء الدقيقة حتى تصبح القناة الصفراوية تاو. قم بعمل قطع أفقي واحد عبر الحليمة بمقص فائق النعومة دون إزاحة القناة الصفراوية من الحليمة أثناء إمساك الأمعاء. أدخل قنية في القناة الصفراوية ثم اسحب الخيط برفق بإحكام حول القنية.
بعد ذلك ، املأ حقنة سعة ثلاثة ملليلتر ب 2.0 مل من خليط البروتياز الكولاجينيز. حقن هذا الخليط في القنية بوتيرة بطيئة وثابتة. بعد اكتمال نفخ البنكرياس ، قم بإزالة القنية من القناة الصفراوية.
بدءا من القولون الهابط ، قم بقص النسيج الضام أثناء سحب الأمعاء لأعلى حتى الوصول إلى القناة الصفراوية. بعد ذلك ، افصل البنكرياس عن الطحال والأنسجة المحيطة. أخيرا ، اقطع الغرز وأزل البنكرياس.
بمجرد إزالته ، ضع البنكرياس في أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من HBSS على الجليد. بمجرد جمع جميع العينات ، ضع أي أنابيب سعة 50 مليلتر تحتوي على أنسجة البنكرياس في حمام مائي بزاوية 37 درجة مئوية. لمدة 15 دقيقة ، هز الأنبوب برفق وتحقق من تفكك الأنسجة.
تأكد من تفكك الأنسجة بسهولة مع تثبيت الأنبوب من الغطاء. قم بالتدوير 12 مرة لمزيد من فصل الأنسجة. أضف ما لا يزيد عن 30 مل من HBSS وأجهزة الطرد المركزي.
قم بشفط المادة الطافية بعناية واترك كمية صغيرة من المادة الطافية في الأسفل حتى لا تعطل لوحة الخلايا. باستخدام حقنة 30 مليلتر متصلة بإبرة قياس 14 ، لا تضيف أكثر من 10 ملليلتر من HBSS واستنشق التعليق لأعلى ولأسفل مرتين. قم بتصفية خليط الخلية من خلال مصفاة بلاستيكية T في أنبوب سعة 50 مل.
شطف مع 10 ملليلتر أخرى, HBSS وأجهزة الطرد المركزي. صب المادة الطافية واقلب الأنابيب لتصريفها على منشفة ورقية ماصة لمدة دقيقة واحدة. أعد تعليق كل أنبوب في 10 ملليلتر.
بارد 1100. له تراكب غير شفاف, له معتم مع 10 ملليلتر, HBSS وأجهزة الطرد المركزي. قم بإزالة 20 مل من المادة الطافية بالكامل باستخدام ماصة كبيرة التجويف سعة 25 مليلتر وقم بتمرير المادة الطافية عبر مرشح مقلوب 70 ميكرون.
قم بتصفية الثقوب مباشرة في طبق بتري واشطفها عن طريق سحب 10 مل من وسائط الثقوب من خلال ثقافة المرشح. الثقوب في حاضنة زراعة الأنسجة حتى تصبح جاهزة للتجريب. غلة العيينة والتشكل والجودة هي المعلمات العامة المستخدمة للحكم على نجاح عزل العيينة.
يظهرمورفولوجيا العيينة النموذجية هنا. الثقوب لها شكل دائري إلى مستطيل بحجم موحد نسبيا. هنا. تم تحليل الثقوب المعزولة لإفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز.
كان تحفيز الأنسولين مشابها بين الثقوب التي أعدتها Sigma Type 11 مقارنة ب ci zyme TM ، MABP مما يشير إلى جودة عالية من تحضير العيون. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقنب قناة الصفراء للفأر. اعمل مع زيم كولاجيناز وبروتياز نيوترو لعزل جفونك لأي فحص.
النظرة العامة
تصف هذه المقالة إجراءً مفصلاً لعزل العينات من البنكرياس الفأري باستخدام قسطرة القناة البنكرياسية في مكانها وخليط الكولاجيناز-البروتياز. تهدف الطريقة إلى تحسين إنتاج العينات ومورفولوجيتها مع التقليل من التباين.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم الغدد الصماء
الخلفية
- خلايا الجزيرة ضرورية لإنتاج الأنسولين.
- تؤدي طرق العزل التقليدية إلى تباين في النتائج.
- استخدام الإنزيمات المنقاة يمكن أن يعزز جودة العينات المعزولة.
- يمكن أن تؤدي البروتوكولات المحسنة إلى تحسين مورفولوجيا العينات.
هدف الدراسة
- لعزل العينات من البنكرياس الفأري بفعالية.
- لتقليل التباين بين المجموعات في مستحضرات الأنزيمات.
- لتحسين مورفولوجيا العينات لأغراض البحث.
الطرق المستخدمة
- عزل البنكرياس الفأري من الأنسجة المحيطة.
- قسطرة القناة الصفراوية لتسريب الأنزيمات.
- نفخ البنكرياس بخليط الكولاجيناز-البروتياز.
- ترشيح العينات المعزولة وزرعها للتجربة.
النتائج الرئيسية
- نجح الفصل والعزل للعينات.
- تحسنت مورفولوجيا العينات بعد العزل.
- أظهرت اختبارات إفراز الأنسولين جودة عالية للعينات.
- أظهرت الطريقة تباينًا أقل مقارنةً بالتقنيات التقليدية.
الاستنتاجات
- الطريقة الموصوفة فعالة لعزل العينات عالية الجودة.
- استخدام الإنزيمات المنقاة يعزز موثوقية النتائج.
- يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة لمجموعة متنوعة من التجارب التي تتضمن العينات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Isolation of primary pancreatic islets enables physiologically relevant assessment of beta cell function, which is critical for diabetes target validation and mechanistic de-risking. Variability in enzyme lot performance compromises reproducibility across discovery campaigns, impacting lead identification and predictive confidence. This protocol addresses lot-to-lot inconsistency through purified collagenase and neutral protease, supporting scalable, standardized islet preparation for preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of intracellular signaling pathways and secretory responses in primary islets, improving target hypothesis validation.
- Operational Value: Reduces biological noise from enzymatic variability, increasing confidence in target engagement readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides consistent islet yield and morphology for reliable glucose-stimulated insulin secretion assays.
- Operational Value: Standardized enzyme composition supports assay reproducibility across laboratories and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant beta cell biology for preclinical efficacy and toxicity studies.
- Operational Value: Facilitates cross-strain comparability when enzyme ratios are adjusted for species-specific tissue characteristics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, where primary islet function informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation using physiologically relevant human-like islet responses.
- Screening: Enables standardized, quantitative assessment of compound effects on insulin secretion.
- Analytics: Generates measurable dependent variables such as insulin secretion levels and islet yield for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-phase target modulation to preclinical outcomes through preserved islet morphology and function.
- Enterprise Reuse: Purified enzyme lots allow protocol reuse across projects, reducing re-optimization burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in beta cell responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of islet isolation across sites and studies.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in diabetes programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable islet-derived functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and pancreatic duct cannulation.
- Dependent on access to purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) with characterized activity.
- Necessitates standardization of enzyme ratios (e.g., 35:10 collagenase:protease) for consistent performance.
- Adaptation may be needed for non-C57BL/6 strains or rat models based on tissue density and enzyme accessibility.
- Practical limitation: Manual dissection and inflation steps constrain throughput without automation.
