Microdialysis من الإيثانول خلال فعال الإيثانول الإدارة الذاتية والايثانول تقرير بواسطة جهاز الكروماتوجرافي الغازي

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة مستويات الإيثانول في غسيل الكلى في الدماغ أثناء جلسة الإدارة الذاتية للإيثانول. من أجل مقارنة هذا الإجراء بسلوكيات الإدارة الذاتية المتزامنة ، يتم تحقيق ذلك عن طريق زرع دليل غسيل الكلى المجهري جراحيا أولا ، والقنية ومسمار الحبل ، ثم تدريب الفئران على إدارة الإيثانول ذاتيا بشكل جراحي. الخطوة الثانية هي تعويد الفئران على حبل مرحلة الرأس حتى لا تعيق الإدارة الذاتية للإيثانول أثناء غسيل الكلى المجهري.

ثم يتم إجراء غسيل الكلى المجهري خلال جلسة الإدارة الذاتية للإيثانول يتم خلالها تحضير جزء من dialate لتحليل الإيثانول. بعد ذلك ، يتم تحليل عينات dialate لتركيز الإيثانول باستخدام كروماتوجراف الغاز مع الكشف عن تأين اللهب. في النهاية ، تظهر النتائج التي تم الحصول عليها المسار الزمني للإيثانول الذي يصل إلى منطقة الدماغ محل الاهتمام خلال جلسة الإدارة الذاتية للإيثانول.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل ثقب الذيل أو الوريد الصافن هي أن هذا الإجراء يكون مزعجا إلى الحد الأدنى في وقت جمع العينة ويسمح بقياس الدواء بمرور الوقت في منطقة الدماغ محل الاهتمام أثناء قيام بمهمة سلوكية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنها تتطلب عددا من المهارات المتخصصة ، والتي لا يمكن اكتساب الكثير منها إلا من خلال الممارسة أو الخبرة المتكررة. كما سيوضح الإجراء جيفري ديلي ، مساعد باحث جامعي في مختبرنا.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية المعروضة من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة تكساس وتتبع جميع الأدلة لرعاية واستخدام لوائح المختبر. جامعة تكساس في أوستن هي منشأة معتمدة من ALAC ، يتم التعامل معها جيدا في فئران إيفانز الطويلة التي تم زرعها جراحيا باستخدام قنية قياس 21 فوق منطقة الدماغ محل الاهتمام في تجارب غسيل الكلى المجهري السلوكية هذه. يجب أن تتلقى جميع أسبوعا واحدا على الأقل من الرعاية والتعافي بعد الجراحة وأن تكون بصحة جيدة قبل البدء في الإجراءات التالية.

ضع الجرذ في غرفة عاملة متوسطة ، مزودة بذراع قابل للسحب وأنبوب قلابة وقم بتدريبه على الضغط على الرافعة للوصول إلى محلول سكروز بنسبة 10٪. بعد تدريب الجرذ على الاستجابة لمحلول السكروز ، ابدأ في ذلك وفقا لجدول تدريب مناسب يضاف خلاله الإيثانول تدريجيا إلى المحلول خلال جلسات شرب متعددة في الليلة السابقة للجلسة الثانية إلى الأخيرة. بعد تخدير والتحقق من مستوى التخدير ، قم بتوصيل زنبرك الحبل بمسمار الحبل على مرحلة رأس الفئران لتعويده على الجهاز الذي يتكون من ذراع موازنة ، وذراع ، وحبل دوار ، ونابض ، وحامل حلقات.

اسمح للفأر بقضاء الليل في غرفة التشغيل في قفص منزله مع التحضير والطعام والماء ، ثم أكمل جلسة التدريب في اليوم التالي باستخدام الحبل والمعدات المصاحبة في مكانه في اليوم السابق لتجربة غسيل الكلى المجهري. بعد تخدير الجرذ بالفلور ، تحقق من التخدير عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم وإدخال مسبار غسيل الكلى المجهري المليء بالسائل الشوكي الدماغي الاصطناعي. قم بتأمين المسبار بشكل مناسب ثم اضبط معدل تدفق المسبار على 0.2 ميكرولتر في الدقيقة.

ضع الجرذ في قفص منزله في غرفة التشغيل لقضاء الليل مع جميع معدات غسيل الكلى في مكانها وإضافة lib والطعام والماء. في اليوم التالي لإدخال المسبار قبل ساعتين على الأقل من بدء التجربة ، قم بتشغيل المسبار إلى معدل تدفق عمله. باستخدام حقنة هاميلتون ، تحقق من أن معدل تدفق المسبار متسق ولا يقل عن 90٪ من معدل التدفق المحدد.

في حالة تقييم الناقلات العصبية في عينات غسيل الكلى ، خذ عينات خلال جميع مراحل التجربة. ابدأ بجمع عينات غسيل الكلى أثناء وجود في قفص منزله. قم بتخزين العينات بطريقة مناسبة لتحليلها لاحقا.

انقل الجرذ بعناية إلى غرفة التشغيل وابدأ البرنامج الفعال الذي يتحكم في الغرفة. استمر في أخذ العينات بينما ينتظر الجرذ حتى تمتد الرافعة إلى الغرفة عينتين قبل أن تمتد الرافعة. ابدأ في جمع جزء من كل عينة غسيل الكلى لتحليل الإيثانول عن طريق سحب كمية مناسبة من غسيل الكلى في قارورة زجاجية سعة ملليلترين وإغلاق القارورة بحاجز محكم الغلق وماصة وإغلاق عينات الإيثانول بسرعة.

نظرا لأن الإيثانول متقلب وحجم العينة صغير ، فإن تحضير العينة غير المتسق أو البطيء سيؤدي إلى نتائج غير دقيقة. تخزين الباقي لتحليل الناقل العصبي. تبدأ فترة الشرب التي تبلغ 20 دقيقة بعد أن يقوم برنامج الكمبيوتر Med Associates بتمديد الرافعة إلى الغرفة ويضغط عليها الفئران للوصول إلى زجاجة من محلول الشرب.

استمر في أخذ العينات طوال فترة الشرب بأكملها بعد فترة الشرب ، يقوم برنامج الكمبيوتر بسحب الزجاجة من الغرفة. احتفظ بالحيوان في الغرفة لمدة 20 دقيقة إضافية بعد الشرب في نهاية تجربة غسيل الكلى المجهري. بعد تخدير الفئران ، قم بإزالة المسبار.

إذا لم يتم القتل الرحيم للحيوان على الفور بشكل إنساني ، فاستبدل السدادة لضمان تصور المسبار. اجمع الدماغ في غضون ثلاثة أيام من التجربة. قم بتحليل العينات جنبا إلى جنب مع معايير الإيثانول الخارجية باستخدام كروماتوجراف الغاز مع كاشف تأين اللهب ، وجهاز أخذ عينات السيارات في مساحة الرأس ، يتم تسخينه إلى 50 درجة مئوية ، وعمود شعري مع الهيليوم كمرحلة متحركة.

لتسجيل وتحليل الكروماتوجرامات ، استخدم برنامج محطة عمل الكروماتوغرافيا لإعداد النظام لتحليل الإيثانول. استخدم حماما مائيا معاد تدويره لتسخين لوحة أخذ عينات السيارات وفتح خزانات الهواء والهيدروجين. بعد ذلك ، ابدأ برنامج بدء التشغيل.

عندما يصبح جاهزا ، ابدأ حرقا لمدة 20 دقيقة ، مما يؤدي إلى تطهير الألياف. ضع معايير باستخدام قارورة حجمية سعة 100 مل لتخفيف 238 ميكرولتر من 95٪ من الإيثانول بالماء إلى حجم نهائي يبلغ 100 ملليلتر. استخدم التخفيف التسلسلي الفردي لإنشاء المعايير.

قم بوضع المعايير في قوارير زجاجية وإغلاقها تماما كما تم تحضير العينات. تأكد من تشغيل فراغ الماء جنبا إلى جنب مع المعايير الخاصة بك. ضع المعايير والعينات في صينية أخذ العينات التلقائية ، وقم بتسخينها حتى يتبخر السائل بالكامل.

لتشغيل المعايير والعينات، قم بإنشاء قائمة عينة تشير إلى العينة التي توجد فيها فتحة جهاز أخذ العينات التلقائي، مع ملاحظة أنه يجب ثقب كل عينة. بمجرد توجيه ملفات البيانات إلى مجلد محدد ، حدد طريقة الاختيار للعينات وابدأ التشغيل. بعد تشغيل النظام من خلال العينات ، تحقق من أن البرنامج قد قام بدمج كل ذروة بشكل صحيح.

المؤامرة ، ارتفاع الذروة كدالة لكل معيار خارجي معروف. تركيز الإيثانول. استخدم الوظيفة الخطية التي توفرها النقاط لاستعاب تركيز الإيثانول لكل عينة غسيل الكلى.

يوضح هذا الشكل مثالا على الكروماتوغرامات لثلاثة تركيزات من معايير الإيثانول وواحد لعينة غسيل الكلى للفئران التي تم جمعها في نهاية جلسة الإدارة الذاتية للإيثانول. يجب أن تكون قمم الإيثانول متماثلة نسبيا ، وأن يكون لها أوقات احتفاظ متسقة ونسبة إشارة إلى ضوضاء أكبر من 10. يعني الفشل في تلبية هذه المعايير أن النظام يتطلب صيانة وكروماتوغرافيا عالية الجودة ، وتنتج المعايير بشكل صحيح منحنى قياسي خطي يستخدم لحساب تركيز الإيثانول لعينات غسيل الكلى التي تم جمعها من الإيثانول ذاتية الإدارة على مدار إدارتها الذاتية.

لا يتم تصحيح تركيزات الإيثانول المستمدة من غسيل الكلى لاستعادة مسبار في الجسم الحي وهي ليست سوى جزء بسيط من تركيز أنسجة الإيثانول في الدماغ. إذا كان غسيل الكلى الدقيق الكمي للإيثانول مطلوبا ، يتم تحديد جزء استخلاص الإيثانول الذي ينتشر من الفضاء خارج الخلية إلى المسبار تجريبيا. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي أربع إلى خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

سيختلف هذا بناء على طول الجلسة السلوكية. يعتمد الانتهاء الناجح من مرحلة غسيل الكلى المجهري من التجربة بشكل كبير على جودة المراحل التحضيرية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التأكد من أن الفئران يتم التعامل معها بشكل جيد وأنك اعتادتها على أي محفزات قد تشتت الانتباه يمكن أن تحدث أثناء تجربة غسيل الكلى حتى لا يتأثر سلوك الإدارة الذاتية للحيوان.