ثابت الطريقة النتوء الضغط التي تسيطر عليها لإعداد الحويصلات الدهن نانو الحجم
يونيو 22, 2012
يصف هذا بروتوكول طريقة قذف لإعداد الحويصلات الدهون من دون ميكرون الأحجام مع وجود درجة عالية من التجانس. هذا الأسلوب يستخدم نظام الضغط التي تسيطر عليها مع تسيطر عليها معدلات تدفق النيتروجين لإعداد الحويصلية. ودهن إعداد 1،2، سيتم تقديم قذف الحويصلية، وتوصيف حجم هنا.
الهدف العام من التجربة التالية هو تقديم طريقة تحضير قوية للحويصلات الدهنية ذات الصلة بيولوجيا. يتم تحقيق ذلك عن طريق خلط ونقل الدهون الفوسفورية إلى قوارير زجاجية وترطيبها بمحلول مائي لإنشاء تعليق SLE متعدد الصفائح. كخطوة ثانية ، يتم تنفيذ طريقة التجميد والذوبان ، والتي تؤدي لاحقا إلى إنتاج حويصلات Ella من حويصلات متعددة الصفائح.
بعد ذلك ، يتم تمرير تعليق الجسيمات الشحمية من خلال آلة بثق باستخدام الضغط الأمثل المحدد لإنتاج حويصلات دهنية متجانسة بالحجم المطلوب. تم الحصول على نتائج تظهر أحجام حويصلات دون ميكرون متسقة بناء على تشتت الضوء الديناميكي وتحليل تتبع الجسيمات النانوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الصوتنة والترسيب ، هي أن هذه الطريقة تستخدم نظام التحكم في الضغط مع معدلات تدفق النيتروجين المحددة المثلى لإعداد حجم حويصلة الدهون بكفاءة.
لبدء هذا الإجراء ، استرجع قارورة زجاجية سعة 20 مليلتر بغطاء مبطن بالتفلون ، ونظف جميع الأواني الزجاجية والمحاقن بالكلوروفورم قبل استخدامها لمنع التلوث. انقل 100 ميكرولتر من الكلوروفورم بدرجة الكاشف إلى القارورة الزجاجية باستخدام حقنة زجاجية محكمة الإغلاق سعة 250 ميكرولتر. أضف 30 ميكرولترا من الميثانول بدرجة الكاشف إلى نفس القارورة الزجاجية باستخدام حقنة زجاجية محكمة الإغلاق سعة 100 ميكرولتر.
قم بإعداد محلول دهني الكوليسترول الخشخاش بملليمولار عن طريق نقل 216 ميكرولتر من 10 ملليغرام لكل مليلتر من البوب C 42 ميكرولتر من 10 ملليغرام لكل ملليلتر. فرقعة ه و 20 ميكرولتر من 11 ملليغرام لكل ملليلتر. تعمل محاليل الكوليسترول في القارورة الزجاجية سعة 20 ملليلتر على تبخير المذيبات العضوية باستخدام الأرجون بطيء التدفق أو غاز النيتروجين حتى يتم ملاحظة طبقة رقيقة من الدهون في قاع القارورة ، ضع القارورة الزجاجية غير المغطى في فراغ مجفف لمدة 30 دقيقة على الأقل.
لإزالة المذيبات المتبقية ، انقل ملليلترين من المخزن المؤقت الذي تم تمريره مسبقا عبر مرشح 0.2 ميكرون إلى القارورة الزجاجية لترطيب الدهون. احتضان الخليط على أربع درجات مئوية طوال الليل واستخدمه في غضون 48 ساعة لأحجام الجسيمات الشحمية من 30 إلى 100 نانومتر. حرر معلق الجسيم الشحمي في النيتروجين السائل لمدة 15 ثانية.
ثم قم بإذابة تعليق الجسيمات الشحمية باستخدام كتلة تسخين عند 42 درجة SIUs لمدة ثلاث دقائق تقريبا. كرر عملية الذوبان بالتجميد لما مجموعه خمس دورات. ينتج عن التجميد والذوبان لاحقا Ella Les من حويصلات متعددة الصفائح ويعزز كفاءة حبس الدهون أثناء البثق.
بعد ذلك ، استعد للبثق باتباع تعليمات Avastin لتجميع شفط الدهون بعناية بهذه السرعة. يعد التجميع الصحيح لآلة البثق LF 50 أمرا بالغ الأهمية لمنع تسرب النيتروجين ، مما يؤثر على معدلات التدفق المرغوبة. لضمان النجاح ، قم بتنفيذ الخطوات التالية بعناية.
لإنتاج ختم محكم. ضع شاشة دعم الفتحة الكبيرة في قاعدة مرشح الدعم متبوعة بطبق مركزي دائري وقرص تصريف واحد وغشاء واحد من البولي كربونات. ضع الحلقة السوداء الصغيرة أعلى الغشاء وثبتها في قاعدة مرشح الدعم.
قم بتوصيل آلة بثق المرشح العلوية عن طريق شد أربعة براغي في الفتحات الأربعة المقابلة. قم بتجميع وحدة بثق المرشح أسفل برميل الطارد الكبير. أضف محلول الجسيم الشحمي إلى برميل الأسطوانة أعلى برميل البثق.
ضع حلقة دائرية كبيرة ، وغطاء ضيق ، وحلقة دائرية كبيرة وغطاء دائري. قم بتوصيل منظم الغاز بأعلى أسطوانة الطارد وأغلق جميع الصمامات لمنع تسرب الهواء، بما في ذلك صمام تخفيف الضغط. ضع قارورة زجاجية سعة 20 مليلتر أو قارورة إرلنماير سعة 50 مليلتر أسفل وحدة مرشح الطارد.
يتم توصيل صمام الأمان بالمنظم وسيتم تحريره إذا تجاوز الضغط 600 حصان. أقوم بتشغيل غاز النيتروجين وفتح صمام الغاز المتصل بالطارد. قم بزيادة ضغط النيتروجين إلى 25 رطل لكل بوصة مربعة للجسيمات الشحمية 400 نانومتر إلى 125 رطل لكل بوصة مربعة للجسيمات الشحمية 100 نانومتر ، وإلى 400 إلى 500 رطل لكل بوصة مربعة للجسيمات الشحمية 30 نانومتر. راقب تعليق الجسيمات الشحمية حتى يخرج في الحاوية أثناء دفعه بواسطة النيتروجين.
حافظ على تدفق النيتروجين حتى لا يلاحظ أي سائل. المرور عبر مرشح الطارد في الملف الزجاجي لإجراء تحليل DLS. أولا ، قم بإعداد 50 ميكرولترا من محلول الجسيم الشحمي 20 ميكرومولار المخفف في محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS.
ثم قم بتشغيل مصدر الطاقة ومصدر المصباح. تابع لفتح برنامج dynapro. اضبط البرنامج على نموذج الخوارزمية للكشف عن الجسيمات الشحمية بالحجم المطلوب.
بعد التوصيل بماصة الأجهزة 14 ميكرولترا من عينة الجسيمات الشحمية في كوارتز وقم بإدخالها في حامل الخلية ، اضغط على Start بعد ما يقرب من 20 إلى 30 عملية استحواذ ، اضغط على STOP. تحليل متوسط قمم قطر الجسيمات الشحمية المسجلة في الرسم البياني. يبدأ تحليل تتبع الجسيمات النانوية بإعداد محلول الجسيم الشحمي 500 ميكرولتر 0.1 ميكرومولار قابل للذوبان في PBS ، وشطف حجرة العينة بالماء والإيثانول.
ثم جفف حجرة العينة بمنشفة ورقية خالية من النسالة. قم بتشغيل مصدر طاقة الليزر وسيقوم الكمبيوتر بتوصيل 300 ميكرولتر من محلول الجسيمات الشحمية 0.1 مولار إلى حجرة العينة. افتح التحكم في درجة الحرارة وبرنامج تحليل تتبع الجسيمات النانوية.
اضغط على زر الالتقاط لتشغيل الليزر. استخدم التعديلات الأفقية والرأسية لتحريك المسرح وضبط تركيز المجهر. اضبط درجة الحرارة المطلوبة ووقت التسجيل.
اضغط على زر التسجيل لالتقاط إطارات صور متعددة لجزيئات الجسيمات الشحمية لفترة زمنية محددة. قم بتحليل القمم المقابلة لأحجام الجسيمات الشحمية ذات القطر على الرسم البياني لأنها تتعقب حركة كل جسيم. DLS هي طريقة راسخة تجمع الضوء المتناثر لتحديد قطر الجسيمات وتم إجراؤها لتحديد أحجام الجسيمات الشحمية.
تم بثق الجسيمات الشحمية الرطبة من خلال أغشية البولي كربونات بأحجام وضغوط مختلفة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. كانت أقطار الجسيمات الشحمية التي تم قياسها بواسطة DLS لحجم المسام 30 نانومتر 66 زائد أو ناقص 28 نانومتر. بالنسبة لحجم المسام 100 نانومتر كان 138 زائد أو ناقص 80 نانومتر ، وبالنسبة ل 400 نانومتر كان حجم المسام 360 زائد أو ناقص 25 نانومتر.
تم استخدام معلق من حبات إيرين المصقولة 50 نانومتر كمعيار معايرة حيث سجل قطرا 47 زائد أو ناقص 16 نانومتر. تظهر النسبة المئوية لتشتت بولي أنه لا يوجد تداخل داخل أحجام الجسيمات الشحمية. من المعتاد ملاحظة أقطار أعلى من 30 نانومتر عند استخدام تحليل DLS بسبب التحيز المعروف لهذه الأداة تجاه الجسيمات الأكبر.
على الرغم من هذا القيد الآلي ، يصف منحنى المعايرة الارتباط الخطي. تحليل تتبع الجسيمات النانوية هو تقنية جديدة تقيس حجم كل جسيم من الملاحظات المباشرة للانتشار في وسط سائل مستقل عن معامل انكسار الجسيمات أو كثافته. يمكن استخدام هذه التقنية عالية الدقة لتكملة قياس الجسيمات الشحمية باستخدام DLS ، وتم استخدام أقطار NTA المسجلة بمقدار 95 زائد أو ناقص 48 نانومتر و 356 زائد أو ناقص 51 نانومتر لمحليل البوليسترين 100 نانومتر و 400 نانومتر للمعايرة.
تتميزالمحاليل الدهنية بقطر أكثر قابلية للمقارنة مع DLS ، وتنتج متوسط أحجام 29 زائد أو ناقص 14 نانومتر لحجم المسام 30 نانومتر ، و 95 زائد أو ناقص 17 نانومتر لحجم المسام 100 نانومتر و 359 زائد أو ناقص 73 نانومتر لحجم المسام 400 نانومتر. قد تكون NTA تقنية توصيف أكثر عمومية لتحديد الجسيمات المجهرية لأن حساسيتها تسمح بقياسات الجسيمات من 50 إلى 1000 نانومتر. يظهر منحنى المعايرة ارتباطا خطيا بين توقف غشاء البولي كربونات مقابل نقل البقع السلبي بقطر NTA المسجل تظهر صور المجهر الإلكتروني كل حجم شحمي بعد أحجام البثق 3 و 100 و 400 نانومتر مميزة بوضوح عن بعضها البعض.
تم ضبط التكبير على 25,000 مرة مع شريط المقياس الذي يمثل 0.5 ميكرون. تم إجراء تجربة دورة زمنية بثلاثة أحجام للجسيمات الشحمية. تم قياس DLS لكل محلول شحمي بعد البثق مباشرة.
تم تخزين جميع محاليل الجسيمات الشحمية عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. تم تسجيل أقطارها مرة أخرى بواسطة DLS بعد حضانة بين عشية وضحاها. لوحظ تغيير طفيف أو معدوم بعد فترة حضانة استمرت 60 ساعة أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن التمريرات المتعددة عبر مرشح البثق ستعمل على تحسين تجانس محلول فيسكو.
تذكرأيضا استخدام القوارير والمحاقن الزجاجية لتحضير العينات لمنع التلوث من خلال الترشيح بواسطة أنابيب البولي بروبلين من الكلوروفورم.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة قوية لتحضير الفجائس الدهنية ذات الصلة بيولوجيًا باستخدام نظام يتم التحكم في الضغط فيه. يضمن هذا البروتوكول درجة عالية من التجانس في أحجام الفجائس الدهنية دون الميكرمتر.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الكيمياء الحيوية
- الفيزياء الحيوية
- النانوتكنولوجي
الخلفية
- الفجائس الدهنية ضرورية للعديد من التطبيقات البيولوجية.
- قد لا توفر الطرق التقليدية مثل الصّوتنة أحجامًا متسقة.
- يمكن للأنظمة التي يتم التحكم في الضغط فيها تحسين عملية التحضير.
- يتم استخدام تشتت الضوء الديناميكي وتتبع الجسيمات النانوية لتحديد حجم الفجائس.
هدف الدراسة
- لتقديم طريقة فعالة لتحضير الفجائس الدهنية.
- لتحقيق درجة عالية من التجانس في أحجام الفجائس.
- لمقارنة فعالية هذه الطريقة بالتقنيات التقليدية.
الطرق المستخدمة
- خلط الدهون الفوسفورية مع محلول عازل مائي لإنشاء تعليق SLE متعدد الطبقات.
- استخدام طريقة التجميد والذوبان لإنتاج فجائس Ella.
- استخدام أداة البثق مع الضغط الأمثل لتعليق الجسيمات الشحمية.
- توصيف أحجام الفجائس من خلال تشتت الضوء الديناميكي وتحليل تتبع الجسيمات النانوية.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق أحجام متسقة للفجائس دون الميكرمتر.
- أظهرت الطريقة مزايا على الصّوتنة والترسيب.
- عززت معدلات تدفق النيتروجين الأمثل من كفاءة التحضير.
- أكدت النتائج على تجانس الفجائس الدهنية المنتجة.
الاستنتاجات
- توفر هذه الطريقة نهجًا موثوقًا لتحضير الفجائس الدهنية.
- تقدم تحسينات كبيرة في اتساق الحجم وتجانسه.
- يعتبر النظام الذي يتم التحكم في الضغط فيه ابتكارًا رئيسيًا في هذا البروتوكول.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Consistent preparation of nano-sized lipid vesicles is critical for biopharma R&D, enabling reliable modeling of membrane dynamics and drug encapsulation studies. The constant pressure-controlled extrusion method addresses longstanding challenges in vesicle size homogeneity, supporting predictive confidence in early discovery and formulation workflows. This capability enhances translational continuity from mechanistic studies to preclinical evaluation of lipid-based delivery systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of membrane curvature effects on protein-lipid and protein-protein interactions.
- Supports functional validation of membrane-associated targets by providing uniform vesicle platforms.
- Facilitates mechanistic de-risking in studies of endocytosis, exocytosis, and membrane fusion.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, size-defined liposomes for standardized assay development.
- Improves assay reliability by minimizing vesicle heterogeneity and batch variability.
- Enables scalable preparation of vesicles for high-throughput compound screening and encapsulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Provides stable vesicle formulations for drug delivery and encapsulation research.
- Ensures continuity in vesicle properties from in vitro mechanistic studies to preclinical models.
- Supports risk-adjusted advancement of lipid-based delivery candidates by demonstrating vesicle stability and size fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both mechanistic studies and formulation development for lipid-based therapeutics.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on membrane curvature and protein trafficking using uniform vesicle systems.
- Screening: Provides assay-ready liposomes with validated size distributions for compound evaluation.
- Analytics: Employs DLS and NTA for quantitative vesicle size measurement and batch-to-batch comparability.
- Translational Research: Maintains vesicle stability and size for downstream preclinical and encapsulation studies.
- Enterprise Reuse: Offers a robust, scalable platform for repeated vesicle preparation across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in membrane biology and drug delivery research.
- Operational Value: Standardizes vesicle preparation, reducing variability and manual error.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by ensuring reliable vesicle properties for downstream studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lipid-based candidates through reproducible formulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid chemistry and vesicle characterization techniques.
- Needs access to pressure-controlled extrusion apparatus and analytical tools such as DLS and NTA.
- Demands rigorous cleaning protocols to prevent sample contamination.
- Adaptable to various lipid compositions and vesicle sizes as supported by protocol.
- Instrumental limitations in size measurement (e.g., DLS bias) should be considered in data interpretation.
