تصنيع واستخدام ميكروأرس المكروية (MEArrays)

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس تأثيرات البيئات الدقيقة المختلفة على الوظائف الخلوية لأنواع الخلايا الملتصقة من خلال تعريضها بالتوازي مع مجموعة متنوعة من البيئات الدقيقة المجمعة. يتم تحقيق ذلك من خلال تصنيع ركائز الطباعة أولا لدعم امتصاص مخاليط البروتينات البيئية الدقيقة. بعد ذلك ، يتم إعداد اللوحات الرئيسية للبروتينات البيئية الدقيقة ، والتي تستخدم لطباعة مصفوفات ME باستخدام روبوت طباعة المصفوفات الدقيقة للريشة أو الدبوس الشعري.

يتم إعداد لوحات رئيسية من البروتينات البيئية الدقيقة. ثم يتم زراعة الخلايا الملتصقة على مصفوفة ME مع خيار الحد من عدد الخلية. تظهر النتائج التي تم الحصول عليها تأثير البيئات الدقيقة المختلفة على الوظائف الخلوية مثل التمايز أو التكاثر بناء على تحليل التألق المناعي.

خطرنا لأول مرة فكرة هذه الطريقة عندما أردنا تحديد تأثيرات البيئات الدقيقة للأنسجة على قرارات مصير الخلايا الجذعية للذاكرة البشرية ، لكننا أدركنا أن العمل في الجسم الحي مستحيل. الآن بعد أن تم تطويره ، له العديد من التطبيقات في بيولوجيا الخلية والبحث واكتشاف الأدوية. يستخدم PDMS كركيزة تحاكي الأنسجة الأكثر صلابة لأنها غير مكلفة وسهلة التحضير وسهلة الطباعة.

ومع ذلك ، يمكن أن تجعله كره للماء PDMS غير متوافق مع بعض خطوط الخلايا عند العمل مع PDMS. يمكن للقفازات غير اللاتكس أن تمنع بلمرة PDMS. للبدء في كوب بلاستيكي يمكن التخلص منه ، امزج قاعدة المطاط الصناعي المصنوعة من السيجار 184 مع عامل المعالجة بنسبة 10 إلى واحد واخلطه بقوة باستخدام خافض لسان خشبي أو بلاستيكي.

بعد ذلك ، قم بإزالة الخليط في جرس فراغ بدرجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. الآن قم بتوسيط شريحة مجهر قياسية على ظرف الفراغ المشغل لمحرك الدوران Coer ثم قم برش 0.5 مل من بوليمر المطاط الصناعي المختلط على مركز سطح الشريحة وقم بتدوير الطبقة عند 6,000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية. عالج الشرائح المطلية ب PDMS عند 70 درجة مئوية لمدة أربع ساعات إلى ليلة كاملة.

يمكن تخزين الشرائح محكمة الهواء في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر. PA عبارة عن هيدروجيل يمكنه تقليد الأنسجة اللينة في النطاق على خلايا PA التي تلتصق فقط بالبقع التي توجد بها بروتينات تدعم التصاق الخلايا. ابدأ بحفر الشرائح بهيدروكسيد الصوديوم.

ضع الشرائح على كتلة حرارية عند 80 درجة مئوية. قم بإسقاط مليلتر واحد من 0.1 هيدروكسيد الصوديوم العادي على كل شريحة. تأكد من تغطية سطح الشريحة بالكامل وإلا ستفشل السلطة الفلسطينية.

اترك هيدروكسيد الصوديوم يتبخر تاركا طبقة بيضاء. كرر هذه العملية إذا لم يكن السطح مغطى بالكامل. يمكن تخزين الشريحة في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام إذا لزم الأمر.

بعد ذلك ، قم بتغطية الشرائح ب PES في غطاء الدخان. ضع الشرائح في طبق سعة 15 مل. أضف 300 ميكرولتر من PES على كل شريحة محفورة بهيدروكسيد الصوديوم.

دع A PES يتفاعل مع شرائح هيدروكسيد الصوديوم لمدة خمس دقائق على وجه التحديد. لم يطول. اغسل A PES جيدا بالماء منزوع الأيونات مرتين إلى ثلاث مرات على جانبي الشرائح.

خلاف ذلك ، سوف يتأكسد لتشكيل رواسب بنية اللون على الشرائح في الخطوة التالية. الآن استنشق جميع المحاليل من أسطح الشرائح إلى كل طبق. أضف 25 ملليلترا من 0.5٪ جلوتارالديهايد في PBS.

ضع الشرائح في الظلام وانتظر 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، قم بشفط كل محلول الجلوتارالديهايد من سطح الشريحة. ثم جفف الشرائح بعناية باستخدام ورق ماص خال من النسالة.

يمكن الآن تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة طوال الليل إذا لزم الأمر. بعد تحضير مخاليط PA وتفريغها ، ضعها على الجليد لإبطاء بلمرتها. قبل تحضير الشرائح إلى كل خليط على الثلج مباشرة ، أضف الأمونيوم لكل كبريتات وتيميد وقم بتقشيرها باستخدام ماصة لمدة خمس إلى 10 ثوان.

الآن ماصة خليط PA على الأسطح المنزلقة. تختلف كمية PA وفقا لصلابة الجل المطلوبة. ثم ضع زلات الغطاء الزجاجي أعلى السلطة الفلسطينية دون ممارسة أي ضغط لتجنب أي تكوين فقاعة.

دع جل PA يتبلمر لمدة ساعتين ثم قم بإزالة زلات الغطاء تحت الماء منزوع الأيونات. اغسل شرائح جل PA بالماء في برطمانات كبيرة طوال الليل. لإزالة مادة الأكريلاميد غير المتفاعلة في اليوم التالي ، جفف الشرائح حتى يتماسك جل PA تماما.

يمكن بعد ذلك تخزين الشرائح عند أربع درجات مئوية لمدة شهر واحد في صندوق منزلق مغلق. للبدء ، يتم تركيب غرفة بلاستيكية لإحاطة المصفوفة المطبوعة من شريحة من غرفتين. قم بإزالة الغرف وقطعها إلى نصفين بشفرة حلاقة.

استخدم طرف ماصة سعة مليلتر واحد لوضع حبة رقيقة من سيليكون حوض السمك على حافة الغرفة واضغط عليها على سطح مصفوفة إيمي. تجنب لمس السيليكون بأي جزء من ميزات المصفوفة. يعد ضمان الارتباط الجيد للحيتان الثقافية بمجموعة إيمي أمرا بالغ الأهمية لأن peria at the elicoties تسمح للوسائط بالتسرب من الغرف ، مما قد يؤدي إلى موت الخلايا على نطاق واسع.

بالنسبة للشرائح المطلية ب PDMS ، قم بحظر الشرائح عن طريق احتضانها في 1٪ onic F 108 لمدة 15 دقيقة تحت الفراغ لأي نوع من أنواع الجل ، اشطف المصفوفات بوسائط زراعة الخلايا بالمضادات الحيوية ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسلة. هذا يزيل المونومرات غير التفاعلية ، والتي يمكن أن تكون سامة للخلايا في حالة المواد الهلامية PA. بعد الغسيل الثالث ، اترك 30 دقيقة إضافية في الوسائط لإعادة ترطيب الجل.

الآن ضع أربعة إلى خمسة مصفوفات في طبق بتري معقم بطول 15 سم. أضف إلى الطبق نصف حجم الوسائط النهائي مع الخلايا ذات الأهمية بالتركيز المطلوب لتطبيقها. يجب وضع المصفوفات ME في حاضنة مناسبة لصيانة نوع الخلية المستخدمة.

تحقق من وجود ارتباط موحد للخلايا بالمعالم المطبوعة تحت المجهر كل 15 إلى 20 دقيقة أثناء المراقبة. هز المصفوفات ME برفق للتمييز بين الخلايا المرفقة والعائمة. سيختلف وقت المرفق، ولكنه يكتمل عادة في غضون ساعتين على صفيف ME مشفر من PA.

بعد الوصول إلى تشبع المرفق أو الحد الزمني ، قم بشفط الخلايا غير المنضمة واملأ الطبق إلى الحجم النهائي على مصفوفات ME المطلية ب PDMS. إزالة جميع الوسائط ستقتل الخلايا. لذلك بالنسبة لجميع تغييرات الوسائط على هذه الشرائح ، استبدل نصف حجم الوسائط على التوالي ثم املأ الطبق بالحجم النهائي.

يمكن أن تستمر الزراعة لعدة أيام مع تغييرات الوسائط العادية. تتوافق المثبتات الشائعة مثل البارافورم والألدهيد والميثانول أسيتون مع أنظمة مصفوفة إيمي. لا تنس أنه حتى عند تلطيخ PDMS المطلي ، يجب أن تظل مصفوفات ME رطبة.

لذا استمر في تقنية استبدال نصف الحجم لإعداد شرائح من مصفوفات ME الملطخة. استخدم شفرة حلاقة لإزالة الغرف وتركيب زلات الغطاء باستخدام النباتات. تم ترسيب بروتين Mount G على مصفوفة ME مطبوعة مشفرة PDMS باستخدام دبابيس سيليكون مربعة على دبوس ريشة.

تم التحقق من ترسب روبوت طباعة المصفوفات الدقيقة للبروتينات المختلفة عن طريق التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة. كانت تخفيفات محاليل البروتين في اللوحة الرئيسية عاكسة للكمية التي تم ترسبها على خلايا سطح طبقات الطباعة المرفقة بالميزات المطبوعة بطريقة منقوشة واضحة. وبالمثل ، يحدث نفس النمط الواضح لربط الخلية عندما تتم طباعة مصفوفة Emmy على مقياس تمرير 40،000.

أثار هلام PA اثنين من بروتينات البيئة الدقيقة ملامح تعبير الكيراتين المعتمدة على التركيز في خط خلية سلف ظهارية ثديية بشرية متعددة القدرات. توضح نسبة السجل لإشارات الكيراتين الثماني إلى إشارات الكيراتين 14 تباين الإشارة وقابليتها للتكرار. بعد 24 ساعة من الثقافة ، يتم غسل الخلايا غير المنضمة في تحليل ل 12 مصفوفات me.

تم استخدام التحليل الإحصائي القياسي لتحديد ما إذا كانت التخفيفات المختلفة للكولاجين من النوع الأول وتكلفة الكاديرين البشري المؤتلف تتغير في التعبير عن الكيراتين. في البداية ، لم يكن هناك اختلاف عن المتوسط بين الخلايا على الميزات بعد التعلق مباشرة. ومع ذلك ، بعد 24 ساعة ، أثارت تركيزات الكولاجين من النوع الأول تعبيرا أعلى بكثير عن الكيراتين الثامن.

في حين أن تركيزات PCA العالية هنا أثارت إشارة قوية للكيراتين 14. تتوافق هذه النتيجة مع التقارير السابقة عن الخلايا السلفية للذاكرة ثنائية القوة. نظرا للطبيعة الديناميكية والمتبادلة لتفاعلات البيئة المكروية للخلايا ، يمكن لهذه الخلايا نفسها تغيير تكوين البيئات المكروية المطبوعة.

لذلك ، لفهم التأثيرات الحادة للبيئات المكروية التي قمت بطباعتها ، يجب ألا يتجاوز وقت التعرض 48 ساعة بعد هذا الإجراء. يمكن أن تكون أي عملية نظرية يمكن قياسها أو بالفلورسنت أو الجلالي كدالة للبيئة المكروية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ، كيف تغير البيئات الدقيقة المختلفة استجابات الأدوية في خطوط السرطان؟ إنه رئيسي من خلال التغيرات في تدلي الجفون والانتشار.

أو كيف تغير البيئات الدقيقة تمايز السلف.