تصنيع واستخدام ميكروأرس المكروية (MEArrays)

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس تأثيرات البيئات المجهرية المختلفة على الوظائف الخلوية لأنواع الخلايا الملتصقة، وذلك عن طريق تعريضها بشكل متوازٍ لمجموعة متنوعة من البيئات المجهرية التوليفية (Combinator microenvironments). ويتحقق ذلك أولاً من خلال تصنيع ركائز طباعة تدعم امتصاص خلائط من بروتينات البيئة المجهرية. بعد ذلك، يتم تحضير ألواح رئيسية من بروتينات البيئة المجهرية، والتي تُستخدم لطباعة مصفوفات البيئات المجهرية (ME arrays) باستخدام روبوت طباعة المصفوفات الدقيقة الذي يعمل إما بنظام الريشة أو الدبوس الشعيري.

بعد ذلك، يتم تحضير ألواح رئيسية من بروتينات البيئة الدقيقة. ثم تُزرع الخلايا الملتصقة على مصفوفة البيئة الدقيقة (ME array) مع إمكانية تحديد عدد الخلايا. وتُظهر النتائج التي تم الحصول عليها تأثير البيئات الدقيقة المختلفة على الوظائف الخلوية مثل التمايز أو التكاثر بناءً على تحليل التألق المناعي.

لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أردنا قياس تأثيرات البيئات الدقيقة للأنسجة على قرارات مصير الخلايا الجذعية الذاكرة البشرية، ولكننا أدركنا أن العمل في الجسم الحي (in vivo) أمر مستحيل. والآن بعد تطويرها، أصبح لها تطبيقات عديدة في بيولوجيا الخلية، والأبحاث، واكتشاف الأدوية. يُستخدم PDMS كركيزة تحاكي الأنسجة الأكثر صلابة لكونه غير مكلف، وسهل التحضير والطباعة.

ومع ذلك، يمكن أن تجعل كره PDMS للماء مادة غير متوافقة مع بعض الخطوط الخلوية عند العمل باستخدام PDMS. يجب استخدام قفازات غير لاتكسية لأن اللاتكس يمكن أن يثبط بلمرة PDMS. للبدء، في كوب بلاستيكي مخصص للاستخدام مرة واحدة، اخلط قاعدة Sygard 184 silicone elastomer مع عامل المعالجة بنسبة 10 إلى 1، وامزجهما بقوة باستخدام خافض لسان خشبي أو بلاستيكي.

بعد ذلك، قم بإزالة الغازات من الخليط في جرس تفريغ في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. الآن، ضع شريحة مجهرية قياسية في مركز قاعدة التثبيت بالتفريغ في جهاز الطلاء الدوراني، ثم صب 0.5 milliliters من بوليمر الإلاستومر المخلوط على مركز سطح الشريحة، وقم بإجراء الطلاء الدوراني بسرعة 6,000 RPM لمدة 60 ثانية. قم بمعالجة الشرائح المطلية بـ PDMS عند درجة حرارة 70 °C لمدة تتراوح من أربع ساعات إلى ليلة كاملة.

يمكن تخزين الشرائح في وعاء محكم الإغلاق في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر. يعد PA هيدروجيل يمكنه محاكاة الأنسجة الأكثر ليونة في النطاق، حيث ستلتصق خلايا PA فقط بالبقع التي توجد بها بروتينات تدعم التصاق الخلايا. ابدأ بنقش الشرائح باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.

ضع الشرائح على كتلة تسخين عند 80 °C. ضع 1 mL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.1 normal على كل شريحة. تأكد من تغطية سطح الشريحة بالكامل وإلا سيفشل الـ PA.

اترك هيدروكسيد الصوديوم يتبخر تاركاً غشاءً أبيض. كرر هذه العملية إذا لم يتم تغطية السطح بالكامل. يمكن تخزين الشريحة في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام إذا لزم الأمر.

بعد ذلك، قم بطلاء الشرائح باستخدام PES داخل خزانة استخلاص الأدخنة. ضع الشرائح في طبق سعة 15 milliliter. أضف 300 µL من PES على كل شريحة تم نقشها باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.

اترك شرائح الـ A PES تتفاعل مع هيدروكسيد الصوديوم لمدة خمس دقائق بالضبط، وليس لفترة أطول. اغسل الـ A PES جيداً بالماء منزوع الأيونات من مرتين إلى ثلاث مرات على كلا جانبي الشرائح.

وإلا فإنه سيتأكسد ليشكل راسباً بنياً على الشرائح في الخطوة التالية. الآن، اسحب جميع المحاليل من أسطح الشرائح إلى كل طبق. أضف 25 milliliters من 0.5%glutaraldehyde في PBS.

ضع الشرائح في مكان مظلم وانتظر لمدة 30 دقيقة. بعد مرور 30 دقيقة، اشفط جميع محلول glutaraldehyde من سطح الشريحة. ثم جفف الشرائح بعناية باستخدام ورق امتصاص خالٍ من الوبر.

يمكن الآن تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة طوال الليل إذا لزم الأمر. بعد تحضير مخاليط PA وإزالة الغازات منها، توضع على الثلج لإبطاء عملية البلمرة. وقبل البدء مباشرة في تحضير الشرائح لكل خليط موجود على الثلج، يتم إضافة كبريتات الأمونيوم والـ TEMED وخلطهما باستخدام الماصة لمدة تتراوح من 5 إلى 10 ثوانٍ.

قم الآن بنقل خليط الـ PA باستخدام الماصة إلى أسطح الشريحة. وتختلف كمية الـ PA وفقاً لصلابة الهلام المطلوبة. ثم ضع أغطية شرائح زجاجية فوق الـ PA دون ممارسة أي ضغط لتجنب تكون أي فقاعات.

اترك هلام PA ليتـبلمر لمدة ساعتين، ثم قم بإزالة شرائح التغطية تحت الماء منزوع الأيونات. اغسل شرائح هلام PA بالماء في أوعية كوبلان كبيرة طوال الليل. ولإزالة الأكريلاميدات غير المتفاعلة في اليوم التالي، جفف الشرائح حتى يتصلب هلام PA تماماً.

يمكن بعد ذلك تخزين الشرائح في درجة حرارة 4 °C لمدة شهر واحد في صندوق شرائح محكم الإغلاق. للبدء، يتم تركيب غرفة بلاستيكية لتحيط بالمصفوفة المطبوعة من شريحة ذات غرفتين. قم بإزالة الغرف وقطعها إلى نصفين باستخدام شفرة حلاقة.

استخدم طرف ماصة سعة 1 mL لوضع طبقة رقيقة من سيليكون أحواض السمك على حافة الغرفة، ثم اضغطها على سطح مصفوفة Emmy. تجنب ملامسة السيليكون لأي جزء من ميزات المصفوفة. إن ضمان الالتصاق الجيد للجدران الثقافية بمصفوفة Emmy أمر بالغ الأهمية؛ لأن الجدران غير الملتصقة تسمح بتسرب الوسط من الغرف، مما قد يؤدي إلى موت الخلايا على نطاق واسع.

بالنسبة للشرائح المطلية بـ PDMS، يتم حجب الشرائح عن طريق تحضينها في محلول مائي من Pluronic F 108 بتركيز 1% لمدة 15 دقيقة تحت تفريغ هوائي لكلا نوعي الهلام، ثم تُشطف المصفوفات باستخدام وسط زراعة الخلايا المضاف إليه مضادات حيوية ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل غسلة. تعمل هذه الخطوة على إزالة المونومرات غير المتفاعلة، والتي قد تكون سامة للخلايا في حالة هلامات PA. بعد الغسلة الثالثة، يُترك الهلام لمدة 30 دقيقة إضافية من التحضين في الوسط لإعادة ترطيبه.

الآن، ضع من أربع إلى خمس مصفوفات في طبق بتري معقم بقطر 15 سنتيمتر. أضف إلى الطبق نصف الحجم النهائي من الوسط الغذائي مع الخلايا المطلوبة بالتركيز اللازم لتطبيقها. يجب وضع مصفوفات ME في حاضنة مناسبة للحفاظ على نوع الخلايا المستخدمة.

تحقق من الالتصاق المتجانس للخلايا بالمعالم المطبوعة تحت المجهر كل 15 إلى 20 دقيقة أثناء المراقبة. رج مصفوفات ME برفق للتمييز بين الخلايا الملتصقة والخلايا العائمة. سيختلف وقت الالتصاق، ولكنه يكتمل عادةً في غضون ساعتين على مصفوفة ME مشفرة بـ PA.

بعد الوصول إلى حالة تشبع الالتصاق أو انتهاء المهلة الزمنية، يتم شفط الخلايا غير المرتبطة وملء الطبق حتى الحجم النهائي على مصفوفات ME المطلية بـ PDMS. إن إزالة جميع أوساط الزرع ستؤدي إلى موت الخلايا، لذا يجب استبدال نصف حجم الوسط أولاً، ثم ملء الطبق بالحجم النهائي عند إجراء جميع عمليات تغيير الأوساط على هذه الشرائح بشكل تتابعي.

يمكن أن تستمر عملية الزراعة لعدة أيام مع إجراء تغييرات دورية للوسط الغذائي. وتتوافق المثبتات الشائعة مثل البارافورمالدهيد، والألدهيد، والميثانول والأسيتون مع أنظمة مصفوفات Emmy. ولا تنسَ أنه حتى عند صبغ المصفوفات المغطاة بـ PDMS، يجب أن تظل مصفوفات ME رطبة.

لذا، استمر في استخدام تقنية استبدال نصف الحجم لتحضير شرائح مصفوفات ME المصبوغة. استخدم شفرة حلاقة لإزالة الغرف وثبّت أغطية الشرائح باستخدام flora. تم ترسيب بروتين G على مصفوفة ME مشفرة ومطبوعة من PDMS باستخدام دبابيس سيليكون ذات رؤوس مربعة على ريشة دبابيس.

تم التحقق من ترسيب بروتينات متنوعة بواسطة روبوت طباعة المصفوفات الدقيقة باستخدام التألق المناعي بواسطة الأجسام المضادة. كانت تخفيفات المحاليل البروتينية في اللوحة الرئيسية تعكس الكمية التي تم ترسيبها على سطح ركيزة الطباعة، حيث ارتبطت الخلايا بالعناصر المطبوعة بطريقة نمطية واضحة. وبالمثل، يحدث نفس النمط الواضح لارتباط الخلايا عند طباعة مصفوفة Emmy على مقياس 40,000 تمريرة.

أدت بروتينات البيئة الدقيقة من هلام PA إلى تحفيز أنماط تعبير عن الكيراتين تعتمد على التركيز في خط خلوي من الخلايا السلفية الظهارية الثدية البشرية متعددة القدرات. ويوضح النسبة اللوغاريتمية لإشارات keratin 8 إلى إشارات keratin 14 التباين وقابلية تكرار الإشارة. وبعد 24 ساعة من الزراعة، يتم غسل الخلايا غير المرتبطة في تحليل لـ 12 مصفوفة me.

استُخدمت التحليلات الإحصائية القياسية لتحديد ما إذا كانت التخفيفات المختلفة من كولاجين النوع الأول والبروتين البشري المؤتلف p cadherin تسبب تغيرات في تعبير الكيراتين. في البداية، لم يكن هناك تباين عن المتوسط بين الخلايا الموجودة على الميزات مباشرة بعد الالتصاق. ومع ذلك، بعد مرور 24 ساعة، أدت التركيزات العالية من كولاجين النوع الأول إلى تحفيز تعبير أعلى بكثير للكيراتين ثمانية.

بينما أدت التركيزات العالية من PCA هنا إلى استحثاث إشارة قوية لـ keratin 14. وتتوافق هذه النتيجة مع التقارير السابقة حول الخلايا السلفية الذاكرة ثنائية القدرة. ونظرًا للطبيعة الديناميكية والمتبادلة للتفاعلات في البيئة الدقيقة لهذه الخلايا، يمكن لهذه الخلايا نفسها أن تغير تكوين البيئات الدقيقة المطبوعة.

وبناءً على ذلك، ولفهم التأثيرات الحادة للبيئات الدقيقة التي قمت بطباعتها، يجب ألا تتجاوز مدة التعريض 48 ساعة بعد اتباع هذا الإجراء. ويمكن تقييم أي عملية نظرية يمكن قياسها، سواء بأسلوب الفلورة أو التحدي، كدالة للبيئة الدقيقة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل: كيف تغير البيئات الدقيقة المختلفة الاستجابة للأدوية في الخطوط السرطانية؟ ويتم ذلك من خلال قياس التغيرات في الموت الخلوي المبرمج والتكاثر.

أو كيف تؤدي البيئات الدقيقة إلى تغيير تمايز الخلايا السلفية.