A التقييم الكمي للهجرة الخليوي من قبل مصلحة دمغ المصوغات المسار على الحركة Phagokinetic

الهدف العام من هذا الإجراء هو أن تكون قادرا على قياس الحركة الخلوية كميا بمرور الوقت باستخدام مقايسة حركة الخلية القائمة على الجسيمات النانوية الذهبية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد زلات الغطاء الزجاجي أولا لطلاء جزيئات الذهب النانوية. على وجه التحديد ، يتم طلاء زلات الغطاء الخالية من السموم الداخلية بالجيلاتين ثم خبزها.

الخطوة الثانية هي تقليل حمض الكلورو أوريك ، والذي سيخلق جزيئات نانوية ذهبية وطلاء الغطاء المطلي بالجيلاتين ينزلق بالتساوي مع المحلول. بعد ذلك ، يتم وضع الخلايا على زلات غطاء طلاء الجسيمات النانوية الذهبية للإطار الزمني المطلوب لخلايا التجربة. من الآن فصاعدا ، سيحل الجيلاتين محل جزيئات الذهب النانوية مما يخلق مسارات.

الخطوة الأخيرة هي مراقبة وقياس حركة الخلية باستخدام الفحص المجهري لتصوير المسارات التي أنشأتها الخلايا المتحركة. في النهاية ، يتم إجراء قياسات مساحة المسارات باستخدام برامج متاحة مجانا. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل التصوير بفاصل زمني ، في أن هذا الاختبار لا يتطلب سوى مجهر ضوئي قياسي وكاميرا قياسية ويستخدم برامج تصوير متاحة مجانا.

بالإضافة إلى ذلك ، يسمح الاختبار أيضا بسهولة بتحليل ومقارنة عينات متعددة باستخدام ميثوديست قادر على فحص عالي الإنتاجية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتأثير العوامل الفسيولوجية المختلفة وحركة الخلايا ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل الدراسات حول تأثيرات مسببات الأمراض على حركة الخلايا المصابة. بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الطرق تتطلب من المرء اتباع الأحجام ودرجات الحرارة المشار إليها بدقة في البروتوكول.

في هذا البروتوكول ، يتم التركيز على تقييم لون المحلول النهائي لجزيئات الذهب النانوية المترسبة لضمان النجاح. العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية. نظرا لأن خطوات فحص حركة المسار الحركي FGO يصعب تعلمها.

تحتوي على العديد من الإجراءات غير المستخدمة بشكل شائع في مختبرات البيولوجيا الخلوية والجزيئية. لتحضير زلات الغطاء المطلية بالجيلاتين ، قم أولا بتعليق الجيلاتين والماء منزوع الأيونات لعمل المحلول بتركيز نهائي يبلغ 0.5 جرام لكل 300 مل ثم قم بتعقيم الخليط لمدة 15 إلى 30 دقيقة. من المهم القيام بذلك في غضون ساعتين من إضافة الجيلاتين في غطاء زراعة الأنسجة.

قم بإعداد زلات الغطاء للطلاء عن طريق نقل ثمانية إلى تسعة زلات غطاء مغسولة بالحمض أولا في طبق بلاستيكي 100 ملم. تأكد من أن زلات الغطاء لا تلامس بعضها البعض أو جوانب الطبق. ضع الماصة بعناية قطرتين إلى ثلاث قطرات من الجيلاتين على كل زلة غطاء لتجنب التدفق الزائد على اللوحة.

ثم ضعي الطبق الذي يحتوي على الغطاء المطلي بالجيلاتين في الفرن واخبزيه على حرارة 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق ، أخرج الطبق من الفرن وأعده إلى المنديل. غطاء الثقافة.

قم بإزالة أي جيلاتين زائد برفق. أعد الطبق إلى الفرن وجفف زلات الغطاء على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. بمجرد أن ينزلق الغطاء ، أخرج الطبق من الفرن وأعده إلى المنديل غطاء المزرعة.

باستخدام إبرة معقمة برفق ، ارفع جانبا واحدا من زلة الغطاء. ثم استخدم ملاقط معقمة لإزالة زلات الغطاء المطلية بالجيلاتين من الطبق ووضعها في آبار منفصلة من لوحة 24 بئر. الخطوة التالية هي تحضير زلات غطاء مغلفة بالذهب الغروي.

ابدأ بتحضير 10 مل من محلول سترات الصوديوم 0.5٪ يعمل في غطاء لزراعة الأنسجة مجتمعة 1.5 مل من محلول حمض الكلورو أوريك 14.5 ملليمولار ، و 13.5 مل من الماء منزوع الأيونات بالأوتوكلاف في قارورة إرلينماير معقمة خالية من السموم الداخلية لكل ثمانية إلى تسع زلات غطاء ، يجب أن تسفر النتيجة عن محلول أصفر باهت. حمض كلورو أوريك سام ويجب التعامل معه بعناية. كما أنها حساسة للضوء ، لذلك يجب تنفيذ خطوة الغليان في ظروف الإضاءة المنخفضة.

عندما يصل المحلول إلى نقطة الغليان ، أخرج القارورة من اللوح الساخن وانقله إلى طبق تحريك. من أجل تكوين جزيئات الذهب الغروية في المحلول ، أضف 0.7 مل من محلول سترات الصوديوم 0.5٪ لكل 15 مل من محلول حمض الكلورو أوريك أثناء التحريك ، واستمر في التقليب لمدة دقيقتين تقريبا. خلال هذا الوقت ، سيتغير المحلول من الأصفر الباهت إلى الشفاف إلى الرمادي إلى الأرجواني إلى الأرجواني الغامق.

قبل الوصول أخيرا إلى نبيذ أحمر أو يفضل لون الصدأ ، ارسم محلول الذهب الغروي في ماصة سعة 10 ملليلتر واترك المحلول يبرد في الماصة لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 0.5 إلى مليلتر واحد فوق زلات الغطاء المطلي بالجيلاتين في صفيحة 24 بئر ضع صفيحة 24 بئر تحتوي على زلات الغطاء المغطاة بالذهب الغروي في حاضنة عند 37 درجة مئوية واحتضنها لمدة 30 دقيقة. بعد أن يكون لدى الجسيمات الوقت لتستقر على زلات الغطاء المطلي بالجيلاتين ، تحقق من كثافتها تحت المجهر الضوئي.

التوزيع المناسب لجزيئات الذهب النانوية على تمييز حواف الشاحنات الشمسية بسهولة وكفاءة. تختلف الكثافة المثلى باختلاف حجم الخلية. إن تركيز جزيئات الذهب المرتفع جدا يعيق قدرة الخلايا على الحركة بينما يحد تركيز جزيئات الذهب والذهب المنخفض جدا من القدرة على تحديد مسار دقيق للحركة.

لهذا السبب ، يجب استخدام قسائم الغطاء فقط التي تم إجراؤها في نفس الدفعة أو التي تم تصميمها لتكون بنفس الكثافة معا في التجارب الفردية. إذا كان تركيز جزيئات الذهب غير كاف ، أضف 0.5 إلى مليلتر إضافي من محلول الذهب الغروي إلى زلات الغطاء المطلي بالجيلاتين. ومع ذلك ، إذا كان تركيز جزيئات الذهب مرتفعا جدا ، مثل الحالة الموضحة هنا ، فإن الخيار الفعال الوحيد هو إعادة صنع محلول الذهب الغروي وطلاء زلات الغطاء الجديدة.

إذا كانت كثافة الجسيمات صحيحة ، فأعد اللوحة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية واحتضنها لمدة ساعة واحدة لشطف جزيئات الذهب غير المرتبطة طوال الليل عن طريق غمس زلزات الغطاء ثلاث مرات في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات. ثم قم بتخزين زلات الغطاء المغلفة بالذهب الغروية في آبار مملوءة ببرنامج تلفزيوني من صفيحة نظيفة من 12 بئر عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. لا ينبغي السماح بقسيمات الغطاء بالجفاف ويجب استخدامها في غضون شهرين إلى ثلاثة أشهر من تاريخ صنعها.

الخطوة التالية هي تحضير زلات الغطاء الغروية المطلية بالذهب لزراعة الخلايا. ابدأ بوضعها في آبار فردية من صفيحة 24 بئرا تمت إضافة ما يقرب من 0.3 مل من وسائط الاستزراع قبل إضافة الغطاء ، تنقل زلات ما يقرب من 5،000 إلى 50،000 خلية على كل زلة غطاء مغلفة بالذهب الغروي. سيختلف رقم الخلية حسب نوع الخلية، ولكن يجب أن تكون كثافة الخلية منخفضة بما يكفي لمنع تداخل مسارات الخلايا من خلايا متعددة في نفس المنطقة.

قم بتغطية اللوحة ووضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست إلى 24 ساعة بناء على حركة نوع الخلية ، يجب تحديد الإطار الزمني الأمثل تجريبيا لكل نوع من أنواع الخلايا بعد الحضانة ، وإصلاح أي زلات غطاء لن يتم تحليلها على الفور عن طريق غمسها أولا مرتين في PBS متبوعا بالحضانة في 3٪ بارا فورمالديهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام تلتقط الصور الخفيفة للمسارات التي تم إنشاؤها بواسطة خلية متحركة واحدة على زلات غطاء غير ثابتة أو ثابتة. يختلف التكبير المستخدم لالتقاط صور للمسارات الخلوية حسب نوع الخلية. ومع ذلك، يجب استخدام نفس التكبير لكل دراسة حتى يتسنى مقارنة النتائج.

بالنسبة للخلايا الوحيدة ، يعمل التكبير 40 × بشكل جيد باستخدام البرامج المتاحة مجانا مثل الصورة أو صورة JNIH أو أداة الصورة لتحديد متوسط مساحة الذهب الغروي التي تم تطهيرها بواسطة 10 إلى 20 خلية أو أكثر لكل عينة من الصور الملتقطة الموضحة هنا هو المسار الذي تم تطهيره لجزيئات الذهب الغروية بواسطة خلية وحيدة واحدة غير محفزة مأخوذة بهدف 40 ×. تخلق الخلايا غير المتحركة مسارات بيضاوية صغيرة أو دائرية مميزة حول نفسها ، مما يشير إلى انخفاض مستوى الحركة التابعة. في المقابل ، تتميز الخلايا عالية الحركة بحركة اتجاهية كمساحات ممدودة ومناطق عامة أكبر بسبب أشكالها غير المنتظمة.

من الأفضل تحليل مسارات الخلايا باستخدام الأداة اليدوية في برنامج Image J لتحديد حجمها. يمكن بعد ذلك إجراء قياسات المنطقة الكمية باستخدام أداة القياس في قائمة التحليل في Image J.أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اتباع الأحجام ودرجات الحرارة المشار إليها في البروتوكول بدقة لأن الانحرافات يمكن أن تؤثر بشدة على النتائج النهائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء زلات غطاء مطلية بالجيلاتين ، وكيفية تحضير جزيئات الذهب النانوية وزلات الغطاء المطلية بجسيمات الذهب النانوية ، وكيفية مراقبة حركة الخلية وتقييمها كميا باستخدام الفحص المجهري الضوئي.

لا تنس أن العمل مع محاليل الغليان على صفيحة ساخنة ، وخاصة الأبخرة من محلول غليان الفلورو وحمض AIC وسيترات الصوديوم يمكن أن يكون احتياطات خطيرة مثل العمل في الغطاء واستخدام الفطرة السليمة يجب دائما اتخاذها أثناء تنفيذ هذا الإجراء.